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Type: DISSERTAÇÃO DIGITAL
Degree Level: Mestrado
Title: Efeito do metilglioxal na agregação plaquetária humana : papel das espécies reativas de oxigênio
Title Alternative: Effect of methylglyoxal in human plaquetary aggregation : the role of reactive oxygen species
Author: Salles, Cléber Alencar, 1967-
Advisor: Antunes, Edson, 1960-
Abstract: Resumo: Metilglioxal (MGO), um metabólito da via da glicólise, tem sido implicado nas complicações cardiovasculares do diabetes. Assim, nós investigamos os efeitos do MGO na geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) e na agregação plaquetária em plaquetas humanas lavadas. Plaquetas humanas (1,5 × 108 plaquetas/ml) foram pré-incubadas com MGO (0,08 - 0,64 mM, 15 min), após as quais foram ativadas com trombina (0,003 - 0,3 U/ml), colágeno (0,1 ¿ 10,0 µg/ml) e U46619 (0.25 - 2,0 µM), análogo do tromboxano. Ensaios de citometria de fluxo utilizando o diacetato de 2'-7'-diclorofluoresceína (DCFH-DA) e dihidroetídio (DHE) foram realizados para avaliar os níveis de EROs em plaquetas. Análises da agregação plaquetária, teste de ELISA (dosagem de GMPc e TXB2) e western blotting (análise das expressões das subunidades ?1 e ?1 da guanilil ciclase solúvel - GCs), foram realizados para identificar possíveis vias de sinalização. Metilglioxal (0,08 e 0,16 mM) elevou significativamente os níveis de EROs, medidos pelas técnicas de citometria através das sondas DCFH-DA ou DHE. Trombina e colágeno individualmente aumentaram significativamente os níveis de EROs, a pré-incubação com MGO não potencializou os níveis de EROs nas plaquetas ativadas, exceto, na ativação com trombina na concentração de 0,3 U/ml. O antioxidante apocinina (100 µM) preveniu a geração de EROs induzida pela MGO. Além disso, o MGO amplificou a agregação plaquetária induzida pela trombina e colágeno, que foi restaurada pela apocinina. Nós testamos ainda a possibilidade da MGO inativar a sinalização óxido nítrico (NO) ¿ guanilato ciclase solúvel (GCs) ¿ monofosfato cíclico de guanosina (GMPc), nas plaquetas. O nitroprussiato de sódio (10 µM) reduziu significativamente a agregação plaquetária induzida pela trombina, colágeno e U46619, aumentando os níveis de GMPc. No entanto, o MGO não modificou nem as respostas mediadas por SNP nem a expressão proteica das subunidades GCs ?1 e ?1. Em resumo, nossos dados mostram que o MGO aumenta os níveis de EROs intraplaqueta e amplifica a agregação plaquetária humana induzida pela trombina, colágeno e U46619, por mecanismos independentes da inativação da sinalização NO-GCs-GMPc. Fármacos capazes de capturar o MGO produzido no organismo, podem ser uma opção para melhorar as complicações da trombose relacionada ao diabetes

Abstract: Methylglyoxal (MGO), a metabolite of the glycolysis pathway, has been implicated in the cardiovascular complications of diabetes. Thus, we investigated the effects of MGO on the generation of reactive oxygen species (ROS) and platelet aggregation in human washed platelets. Human platelets (1.5 × 108 platelets/ml) were preincubated with MGO (0.08-0.64 mM, 15 min), after which they were activated with thrombin (0.003-0.3 U/ml) or collagen (0.1-10.0 ?g/ml) and U46619 (0.25 - 2.0 ?M) analogue of thromboxane. Flow cytometry assays using 2'-7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) and dihydroethidium (DHE) techniques were carried out to evaluate platelet ROS levels. Platelet aggregation, ELISA (measurement of cGMP and TXB2) and western blotting (analysis of soluble guanylyl cyclase ?1 and ?1 subunits) were performed to identify possible signaling pathways. Methylglyoxal (0.08 and 0.16 mM) significantly elevated the ROS levels, as measured by either DCFH-DA or DHE techniques. Thrombin and collagen individually increased ROS levels significantly, pre-incubation with MGO did not potentiate ROS levels in activated platelets, except for activation with 0.3 U/ml thrombin. The antioxidant apocynin (100 ?M) prevented the MGO-induced ROS generation. In addition, MGO amplified the platelet aggregation induced by thrombin and collagen, which was restored by apocynin. We further tested the possibility of MGO inactivating the nitric oxide (NO) - soluble guanylate cyclase (sGC) - cyclic guanosine monophosphate (cGMP) signaling in platelets. Sodium nitroprusside (10 ?M) significantly reduced platelet aggregation induced by thrombin, collagen and U46619, increasing cGMP levels. However, MGO modified neither the SNP-mediated responses or the protein expression of the sGC ?1 and ?1 subunits. In summary, our data show that MGO increases intracellular ROS levels and amplifies human platelet aggregation induced by thrombin, collagen and U46619, by mechanisms independent of the inactivation of NO-sGC-cGMP signaling. MGO scavengers could be an option to ameliorate diabetes-related thrombosis complications
Subject: Produtos finais de glicosilação avançada
Guanilato ciclase
GMP cíclico
Dihidroetídio
Language: Português
Editor: [s.n.]
Citation: SALLES, Cléber Alencar. Efeito do metilglioxal na agregação plaquetária humana: papel das espécies reativas de oxigênio. 2019. 1 recurso online (83 p.). Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas, Campinas, SP.
Date Issue: 2019
Appears in Collections:FCM - Tese e Dissertação

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