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Type: DISSERTAÇÃO DIGITAL
Degree Level: Mestrado
Title: Desenvolvimento de ensaios para quantificação de atividade das vias de degradação cotraducional
Title Alternative: Assays development to quantify the cotranslational degradation pathways
Author: Valença, Aline Gazzola Fragnani, 1991-
Advisor: Bengtson, Mário Henrique, 1975-
Abstract: Resumo: O reconhecimento e eliminação de proteínas defeituosas são essenciais para a manutenção da integridade e funcionamento da célula. O acúmulo de proteínas com dobramento incorreto e perturbação na proteostase celular, por exemplo, são implicados no envelhecimento e desenvolvimento de neurodegeneração. Estudos atuais mostram que de 15 a 30% das proteínas recém-sintetizadas em eucariotos são degradadas rapidamente durante a tradução (cotraducionalmente), antes mesmo de serem liberadas do ribossomo. Uma das principais proteínas envolvidas neste processo é proteína E3 ubiquitina ligase Listerin, codificada pelo gene LTN1, cuja mutação leva ao desenvolvimento de uma doença neuromotora em camundongos, muito parecida com a esclerose lateral amiotrófica humana. Isso sugere que o acúmulo de proteínas defeituosas, que deveriam ser degradadas cotraducionalmente, possa estar relacionado com o desenvolvimento de doenças neurodegenerativas humanas. Para testar esta hipótese, propusemos neste trabalho: 1) padronizar um ensaio para medir o funcionamento das vias de ubiquitinação/degradação cotraducional e 2) verificar se a redução da função de genes relacionados à tradução, e nos quais foram identificas mutações responsáveis por causar doenças neurodegenerativas em pacientes, aumentam/saturam as vias de ubiquitinação/degradação cotraducional. Assim, iniciamos a padronização de dois ensaios: 1) Um ensaio para quantificar a ubiquitinação cotraducional, baseado na marcação de cadeias nascentes com um composto híbrido de biotina-puromicina, seguida de purificação das cadeias nascentes com beads conjugadas com estreptavidina e western blot para detecção das cadeias ubiquitinadas; e 2) Identificação e teste de alvos endógenos da via de LTN1, os quais poderiam ser usados como marcadores endógenos do funcionamento desta via. Além disso, construímos e confirmamos o funcionamento de vetores de silenciamento gênico para os genes mutados em neurodegeneração EEF2, ELP3 e SETX, além de LTN1. Após uma série de otimizações, chegamos a um protocolo próximo de ser capaz de medir a ubiquitinação/degradação cotraducional e sugestões de como torná-lo funcional. No ensaio de identificação e detecção de alvos endógenos, encontramos um potencial candidato, ZNF622, a marcador do funcionamento da via, o qual deverá ser confirmado em outros testes. Além dos resultados obtidos, identificamos uma proteína da família das RNA helicases, que potencialmente se associa mais a ribossomos de células depletadas de ELP3, e que pode ter relação com a neurodegeneração em pacientes com mutação para este gene. Esperamos que nosso trabalho contribua para o entendimento das vias de ubiquitinação/degradação cotraducional e de sua relação com doenças humanas

Abstract: Recognition and elimination of defective proteins are essential for maintaining integrity and regular cell functions. Accumulation of proteins with incorrect folding and disturbance in cellular proteostasis are implicated in aging and neurodegeneration development, for instance. Current studies show that around 15 to 30% of newly synthesized proteins in eukaryotes are rapidly degraded during translation (cotranslationally), even before they are released from the ribosome. One key protein involved on this process is the E3 ubiquitin ligase Listerin, encoded by the LTN1 gene, whose mutation leads to motor neuron disease development in mice, very similar to human amyotrophic lateral sclerosis. These findings suggest that the accumulation of defective proteins, which should be degraded cotranslationally, may be involved in human neurodegenerative diseases development. In order to test this hypothesis, we proposed: 1) to standardize an assay to measure cotranslational ubiquitination/degradation pathways activity and 2) to verify whether decreasing function of genes involved in translation, whose mutations are responsible for neurodegenerative diseases development in patients, increases/saturates the cotranslational ubiquitination/degradation pathways. Therefore, we initiated the standardization of two assays: 1) An assay to quantify cotranslational ubiquitination, based on labeling nascent chains with a biotin-puromycin hybrid compound, followed by purification of the nascent chains with streptavidin conjugated beads and western blot for detection of ubiquitinated chains; and 2) Identification and testing of endogenous targets of the LTN1 pathway, which could be used as endogenous markers to the pathway activity. In addition, we constructed and confirmed the efficiency of gene silencing vectors for mutated genes in neurodegeneration EEF2, ELP3 and SETX and LTN1. After a series of optimizations, we obtained a protocol close to being able to measure the cotranslational ubiquitination/degradation and we got suggestions on how to make it functional. In the endogenous targets identification and detection, we found a potential candidate, ZNF622, to a pathway marker, which should be confirmed in other tests. In addition to the results obtained, we identified a protein from the RNA helicases family, which potentially increases association with ribosomes in ELP3 depleted cells, and which may be related to neurodegeneration in patients with ELP3 mutations. We hope that our work contributes to understanding the cotranslational ubiquitination/degradation pathways and its relationship to human diseases
Subject: Proteólise
Ubiquitinação
Doenças neurodegenerativas
Inativação gênica
RNA interferente pequeno
Language: Português
Editor: [s.n.]
Citation: VALENÇA, Aline Gazzola Fragnani. Desenvolvimento de ensaios para quantificação de atividade das vias de degradação cotraducional. 2018. 1 recurso online (83 p.). Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP.
Date Issue: 2018
Appears in Collections:IB - Tese e Dissertação

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