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Type: TESE DIGITAL
Degree Level: Doutorado
Title: Novas estratégias de tipificação e diagnóstico de materiais biológicos por espectrometria de massas
Title Alternative: New strategies for the typification and diagnosis of biological samples by mass spectrometry
Author: Porcari, Andréia de Melo, 1983-
Advisor: Eberlin, Marcos Nogueira, 1959-
Abstract: Resumo: Este trabalho demonstra a aplicação de técnicas de espectrometria de massas (MS) para a análise de diferentes materiais biológicos, nos âmbitos clínico e alimentício. Foram realizados dois projetos individuais, que resultaram em um artigo já submetido e um artigo publicado. O primeiro artigo tratou da descoberta de assinaturas moleculares para lesões cervicais de alto grau relacionadas ao câncer de colo do útero. Este câncer é o quarto tipo mais comum entre as mulheres, sendo causado pelo vírus do Papilloma Humano (HPV). Os métodos de triagem existentes ainda são falhos em especificidade e sensibilidade, reduzindo a eficácia de programas de prevenção. Infecções autolimitadas por HPV são clinicamente insignificantes, mas necessitam ser discriminadas de infecções pré-neoplásicas causadas pelo mesmo vírus. Assim, há demanda para marcadores virais ou humanos capazes de fazer tal diferenciação. Neste projeto é demonstrado o desenvolvimento de um método de metabolômica por MS acoplada à cromatografia líquida (LC-MS) para encontrar assinaturas moleculares para detecção de lesões intraepteliais de alto grau (HSIL). Para tal, amostras cervicais foram coletadas, num meio específico, em mulheres diagnosticadas como tendo cervix normal (N=40) e mulheres portadoras de HSIL diagnosticadas a partir de exame prévio (N=40). As amostras foram submetidas a análise de citologia em base líquida, detecção de DNA-HPV e análise por LC-MS. Tratamento estatístico multivariado foi aplicado aos dados. Foram encontradas três assinaturas moleculares para detecção de HSIL relacionadas ao metabolismo de lipídios complexos (esfingolipídios). Tais compostos foram observados em portadoras de HSIL, em comparação com grupo controle contendo pacientes assintomáticas e positivas para infecção por HPV, revelando que se tratam de marcadores ligados ao fenótipo metabolômico dessas pacientes e não ao genótipo. No segundo capítulo, a MS é utilizada para caracterização lipídica de caviar, produto de alto valor agregado. Desejava-se conhecer o efeito de métodos de processamento (salga ou salga+pasteurização), e das condições de armazenagem (refrigerado ou a temperatura ambiente), sobre a composição lipídica deste alimento. Para tal utilizaram-se diferentes plataformas em MS: (i) análise por MALDI-MS; análise por TI-EASI-MS (thermal-imprinting - easy ambient sonic-spray ionization) e (iii) análise por ESI-FT-ICR-MS (Fourier transform ion cyclotron resonance). Essas técnicas possibilitaram a diferenciação dos tipos de amostras de acordo com o processamento e mudanças foram observadas devido ao tempo e condições de armazenagem. Essa diferenciação foi possível pela observação do aumento de adutos de sódio nos íons característicos da amostra. Observou-se ainda a diminuição da intensidade de íons de fosfolipídios (PL), atribuída à processos de hidrólise. A análise por MALDI detectou principalmente PL, enquanto a extração/análise por TI-EASI-MS detectou ambos os perfis de PL e triacilgliceróis (TAG), possibilitando uma análise mais abrangente do conteúdo lipídico. A análise por ESI(+)-FT-ICR-MS possibilitou a atribuição dos íons, bem como a confirmação de que não são formados produtos de oxidação decorrentes da extração por TI

Abstract: This work has as main objective to demonstrate the application of mass spectrometry (MS) methodologies for the analysis of different biological specimens, for clinical and food domains. It is presented here divided in two articles: the first one has just been submitted for publication whereas the second has already been published on an international journal. The first manuscript brings the search for molecular signatures for high grade cervical lesions, related to cervical cancer, using metabolomics through MS. Cervical cancer is the fourth most common neoplasia in women and the infection with human papillomavirus (HPV) is its necessary cause. Current screening methods display low specificity/sensitivity, reducing the efficacy of cervical cancer screening programs. Herein, molecular signatures of cervical cytologic specimens revealed by liquid chromatography ¿ mass spectrometry (LC-MS), were tested in their ability to provide a metabolomic screening for cervical cancer. These molecules were tested whether they could clinically differentiate insignificant HPV infections from precancerous lesions. For that, high-grade squamous intraepithelial lesions (HSIL)-related metabolites were compared to those of no cervical lesions in women with and without HPV infection. Samples were collected from women diagnosed with normal cervix (N=40) and from those previously detected with HSIL (N=40). Liquid-based cytology diagnosis, DNA HPV-detection test and LC-MS analysis were carried out for all the samples. The same sample, in a customized collection medium, could be used for all the diagnostic techniques here employed. The metabolomic profile of cervical cancer provided by LC-MS was found to indicate unique molecular signatures for HSIL, being two ceramides and a sphingosine metabolite. These molecules occurred independently of women¿s HPV status and could be related to the pre-neoplastic phenotype. Statistical models based on such findings could correctly discriminate and classify HSIL and no cervical lesion women. The results showcase the potential of LC-MS as an emerging technology for clinical use in cervical cancer screening. On the second article, the lipid profile of Sturgeon roe (caviar) was monitored by matrix assisted laser desorption/ionization-MS (MALDI(+)-MS), thermal imprinting easy ambient sonic-spray ionization MS (TI-EASI(+)-MS) and electrospray MS (ESI(+)-MS). Freshly salted and commercially salted pasteurized caviar samples of Atlantic sturgeon (Acipenser sturio) were stored either at +4 oC or at room temperature for 4 weeks. The different types of chemical information achieved by these MS techniques were compared: MALDI(+)-MS detects mainly phospholipids (PL) whereas TI-EASI(+)-MS allows monitoring of both triacylglycerols (TAG) and PL. ESI(+) coupled to Fourier transform ion cyclotron resonance high resolution MS (FT-ICR-MS) and MS/MS experiments were used to fully characterize the detected lipids, ensure the absence of oxidation products in the degradation process and confirm the high efficiency of the thermal imprinting extraction. TI-EASI(+)-MS, via a more comprehensive profiling and easier operation, has therefore been demonstrated to provide caviar lipidomic profiles and discriminate its changes as a function of storage time and temperature. The data have also confirmed that hydrolysis is the main process of lipid degradation in caviar
Subject: Espectrometria de massa
Metabolômica
Neoplasia intra-epitelial cervical
Lipidômica
Tecnologia de alimentos
Language: Multilíngua
Editor: [s.n.]
Citation: PORCARI, Andréia de Melo. Novas estratégias de tipificação e diagnóstico de materiais biológicos por espectrometria de massas. 2018. 1 recurso online (80 p.). Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química, Campinas, SP.
Date Issue: 2018
Appears in Collections:IQ - Tese e Dissertação

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