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Type: TESE DIGITAL
Degree Level: Doutorado
Title: Construção de uma comunidade sintética bacteriana promotora do crescimento vegetal oriunda do microbioma da cana-de-açúcar : Construction of a plant growth-promoting synthetic bacterial community from the sugarcane microbiome
Title Alternative: Construction of a plant growth-promoting synthetic bacterial community from the sugarcane microbiome
Author: Armanhi, Jaderson Silveira Leite, 1991-
Advisor: Arruda, Paulo, 1952-
Abstract: Resumo: As comunidades microbianas associadas às plantas podem promover o crescimento e desenvolvimento vegetal por diversos mecanismos, como produção de fitormômios, repressão de patógenos, resistência a estresses e captação de nutrientes. Cultivar esses micro-organismos benéficos é um passo essencial para a compreensão desses mecanismos. No entanto, metodologias tradicionais de cultivo e isolamento microbiano são comumente baseadas no screening de micro-organismos com atividades de promoção de crescimento já conhecidas ou de grupos filogenéticos específicos. Por esse motivo, embora essas abordagens tenham contribuído para o entendimento de atividades microbianas já amplamente estudadas, tendem a limitar a descoberta de novas funções essenciais na interação micro-organismo¿planta. Além disso, como esses métodos se baseiam exclusivamente em culturas axênicas, são laboriosos, custosos e podem resultar em perdas de informações biológicas relevantes devido a dependências mútuas estritas entre micro-organismos. Em cana-de-açúcar, nas últimas décadas, grandes esforços têm sido realizados no estudo de comunidades bacterianas diazotróficas. Mais recentemente, nosso grupo de pesquisa mostrou a existência de inúmeros outros grupos microbianos altamente abundantes em associação com a cana-de-açúcar e nunca investigados quanto às suas funções em plantas. Aqui descrevemos novas abordagens para o screening, seleção e validação de micro-organismos benéficos às plantas com base em um contexto ecológico, como abundância relativa e dinâmica de colonização, independente de classificação taxonômica ou funções pré selecionadas. Em um primeiro momento, desenvolvemos uma estratégia denominada "coleção de cultura baseada em comunidade" (CBC) a partir da seleção de colônias contendo um ou múltiplos micro-organismos. O racional consiste em contornar os impasses das técnicas tradicionais, reduzir o trabalho de isolamento de culturas puras e permitir que comunidades naturais sejam armazenadas. Desenvolvemos um método multiplex de sequenciamento de amplificados do gene do RNA ribossômico 16S para identificação em larga escala da composição de bactérias de cada comunidade armazenada. Então, descrevemos um pipeline de bioinformática para referenciar as bactérias armazenadas à diversidade bacteriana associada à cana-de-açúcar, com o propósito de construir uma comunidade sintética composta exclusivamente por bactérias altamente abundantes na planta. Por fim, a comunidade sintética bacteriana foi validada quanto à sua habilidade de promoção do crescimento vegetal através de ensaios de inoculação em uma planta modelo. Aplicamos esses procedimentos para explorar bactérias benéficas em associação com a cana de açúcar, já que a maioria delas ainda é pouco estudada. Criamos uma CBC a partir do isolamento de 5.137 colônias microbianas oriundas da raiz e colmos de cana-de-açúcar. Após o sequenciamento e cruzamento dos dados, verificamos que recuperamos grupos de bactérias que representam 15,9% e 61,6¬¿65,3% do microbioma da rizosfera e da porção endofítica dos colmos, respectivamente. Desenhamos uma comunidade sintética, composta por grupos de bactérias abundantes na cana-de-açúcar, inoculada em plantas de milho. Ensaios de inoculação mostraram que membros da comunidade sintética bacteriana colonizaram eficientemente os órgãos da planta, deslocaram sua microbiota natural e dominaram 53,9% da abundância bacteriana da rizosfera. Além disso, plantas inoculadas aumentaram 3,4 vezes em biomassa. Em conjunto, os resultados apresentados neste trabalho compreendem métodos inovadores aplicáveis ao isolamento e identificação de micro-organismos em larga escala, além do conceito do desenho de comunidades microbianas sintéticas baseadas no perfil do microbioma vegetal para para o acesso a micro organismos benéficos às plantas

Abstract: Plant-associated microbial communities can promote plant growth and development by several mechanisms, such as the production of phytohormones, repression of pathogens, stresses resistance and nutrient uptake. Culturing these beneficial microbes is an essential step towards understanding these mechanisms. However, traditional methods of microbial cultivation and isolation are commonly based on screening for known plant growth-promoting microbial activities or specific phylogenetic groups. Therefore, although these approaches provide a better understanding of well-studied microbial traits, they tend to limit the discovery of novel essential functions in plant microbe interaction. Besides, as these methods are exclusively based on axenic cultures, they are time-consuming, expensive and may result in losses of relevant biological information due to strict mutual dependences between microbes. In sugarcane, in the past decades, considerable efforts have been made to study diazotrophic bacterial communities. More recently, our research group has shown that there are several other highly abundant microbial groups inhabiting sugarcane that have never been investigated regarding its functional role in plants. Here we described innovative approaches to screen, target and validate plant beneficial microorganisms based on the ecological context, such as relative abundance and colonization dynamics, regardless of their taxonomic affiliation or preselected functions. First, we developed a strategy called "community-based culture collection" (CBC) based on isolating microbes by selecting colonies that may contain single or multiple microorganisms. The rationale is to bypass all given impasses by traditional techniques, reduce the laborious work of pure cultures isolation and allow naturally occurring communities to be stored. We developed a multiplexing 16S rRNA gene amplicon sequencing method that allowed identifying the bacterial composition of each isolated community in a high throughput manner. Then, we described a bioinformatics pipeline to cross reference the stored bacteria and all bacterial diversity associated with sugarcane, with the purpose of constructing a synthetic community composed exclusively of highly abundant bacteria in the sugarcane plant. Then, the synthetic bacterial community was validated for its plant growth promoting ability in inoculation experiments in a plant model. We have applied these procedures to explore beneficial bacteria in association to sugarcane as most of them are still understudied. The sugarcane CBC was created by isolating 5,137 microbial colonies from root and stalks. After sequencing and cross-referencing, we found that we successfully recovered bacterial groups accounting for 15.9% and 61.6¿65.3% of the rhizosphere and the endophytic microbiomes of stalks, respectively. The synthetic community was composed of several highly abundant bacteria in sugarcane and inoculated in maize plants. Members of the synthetic bacterial community efficiently colonized plant organs, displaced the natural microbiota and dominated 53.9% of the rhizosphere bacterial abundance. Also, inoculated plants dramatically increased biomass by 3.4-fold. Taken together, the results presented in this work comprise innovative methods applicable to large scale microbial isolation and identification, and the concept of designing synthetic microbial communities based on plant microbiome profile for screening plant beneficial microorganisms
Subject: Microbiota
Cana-de-açúcar
Bactérias
Plantas - Inoculação
Fenótipo
Milho
Comunidades microbianas
Language: Multilíngua
Editor: [s.n.]
Citation: ARMANHI, Jaderson Silveira Leite. Construção de uma comunidade sintética bacteriana promotora do crescimento vegetal oriunda do microbioma da cana-de-açúcar: Construction of a plant growth-promoting synthetic bacterial community from the sugarcane microbiome. 2018. 1 recurso online (148 p.). Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP.
Date Issue: 2018
Appears in Collections:IB - Tese e Dissertação

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