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Type: TESE DIGITAL
Degree Level: Doutorado
Title: Protease from Bacillus licheniformis : production, purification, characterization and application of the enzyme in the hydrolysis of rice and pea proteins = Protease de Bacillus licheniformis: produção, purificação, caracterização e aplicação da enzima na hidrólise das proteínas de arroz e ervilha
Title Alternative: Protease de Bacillus licheniformis : produção, purificação, caracterização e aplicação da enzima na hidrólise das proteínas de arroz e ervilha
Author: Santos, Jessika Gonçalves dos, 1988-
Advisor: Sato, Helia Harumi, 1952-
Abstract: Resumo: Os efeitos da ampliação de escala e de diferentes variáveis de processo (temperatura e agitação) sobre a produção de proteases por Bacillus licheniformis LBA 46 foram avaliados utilizando meio de cultura composto por melaço de cana¿de¿açúcar (32 g/L), água de maceração de milho (6 g/L), extrato de levedura (2 g/L) e soro de leite (20 g/L), pH 7. Os resultados obtidos mostraram que o aumento da escala de fermentação de frascos Erlenmeyer contendo 100 mL de meio de cultura para reator de bancada contendo 3 L de meio resultou em aumento de 2,3 vezes na atividade enzimática, sendo obtido 2.448 U/mL de protease após 48 h de fermentação e que as condições mais adequadas de temperatura e agitação foram 30 ºC e 300 rpm, respectivamente. O extrato bruto de proteases foi submetido à precipitação com sulfato de amônio (80% de saturação), diálise e liofilização para posterior caracterização bioquímica. A preparação enzimática semi¿purificada apresentou atividade ótima na faixa de 60 e 65 °C em pH 7 e reteve 78%, 39% e 9% da atividade inicial após 120 min de tratamento a 50, 60 e 70 ºC, respectivamente. A protease foi purificada 3,33 vezes por precipitação com 80% de sulfato de amônio e cromatografia em coluna de DEAE¿Sepharose, apresentando uma massa molecular de 40 kDa estimada por eletroforese por SDS¿PAGE. A protease purificada apresentou atividade ótima na faixa de 50 e 60 °C. A enzima purificada apresentou alta atividade (> 80%) na faixa 6,5 a 9, tendo atividade ótima em pH 8,5; bem como mostrou¿se estável na faixa de pH 5 a 10 após 24 h de incubação a 4 ºC, retendo mais de 86% da atividade inicial. A enzima purificada também se mostrou estável após 1 h de incubação a 40 ºC e reteve 85% da atividade inicial após 1 h a 50 ºC. O tratamento da protease semi¿purificada (obtida por precipitação com 80% de sulfato de amônio) em pH 4, 7 e 9, com homogeneização a alta pressão (50 ¿ 200 MPa) não aumentou sua atividade e estabilidade em 40, 60 e 90 °C. Os hidrolisados de proteína de arroz preparados com a protease de B. licheniformis LBA 46 e protease comercial Alcalase 2.4L apresentaram atividade antioxidante superior para as respostas avaliadas pelos métodos de ORAC e FRAP em comparação com proteína de arroz não hidrolisada. Os hidrolisados de proteína de ervilha preparados com a protease de B. licheniformis LBA 46 e protease comercial Alcalase 2.4L apresentaram atividade antioxidante para todas as respostas avaliadas pelos métodos DPPH, ORAC e FRAP. A atividade antioxidante dos hidrolisados de proteína de ervilha medida em termos de DPPH e FRAP foi menor em comparação com a atividade antioxidante da amostra de proteína não hidrolisada. No entanto, a atividade antioxidante medida em termos do ORAC teve um aumento significativo de 7,33 e 9,27 vezes para os hidrolisados da protease LBA e para os hidrolisados da Alcalase 2.4L, respectivamente, comparada com a proteína não hidrolisada. As condições de hidrólise foram validadas e, na condição selecionada como mais adequada (pH 10 e 100 U/mL de protease), foi possível confirmar que os modelos definidos foram capazes de predizer os resultados alcançados

Abstract: The effects of scale amplification and different process variables (temperature and agitation) on the production of proteases by Bacillus licheniformis LBA 46 were evaluated using culture medium composed of sugar cane molasses (32 g/L), corn steep liquor (6 g/L), yeast extract (2 g/L) and dried whey (20 g/L), pH 7. The results obtained showed that the increase in the fermentation scale of Erlenmeyer flasks containing 100 mL of broth culture medium to a bench reactor containing 3 L of medium resulted in a 2.3¿fold increase in enzyme activity, obtaining 2,448 U/mL protease after 48 h of fermentation and the most suitable conditions of temperature and agitation were 30 ºC and 300 rpm, respectively. The crude protease extract was submitted to ammonium sulphate precipitation (80% of saturation), dialysis and lyophilization for subsequent biochemical characterization. The semi¿purified enzymatic preparation presented optimum activity in the 60 and 65 ºC range at pH 7 and retained 78%, 39% and 9% of the initial activity after 120 min of treatment at 50, 60 and 70 ºC, respectively. The protease was purified 3.33 times by precipitation with 80% ammonium sulfate and DEAE¿Sepharose column chromatography, presenting a molecular mass of 40 kDa estimated by SDS¿PAGE electrophoresis. The purified protease presented optimum activity in the range of 50 and 60 ºC. The purified enzyme presented high activity (> 80%) in the range of 6.5 to 9, and had optimal activity at pH 8.5; as well as showed to be stable in the pH range of 5 to 10 after 24 h of incubation at 4 ºC, retaining more than 86% of the initial activity. The purified enzyme also showed to be stable after 1 h of incubation at 40 ºC and retained 85% of the initial activity after 1 h at 50 ºC. Treatment of semi¿purified protease (obtained by precipitation with 80% ammonium sulphate) at pH 4, 7 and 9, with high pressure homogenization (50 ¿ 200 MPa) did not increase its activity and stability at 40, 60 and 90 ºC. Rice protein hydrolysates prepared with the B. licheniformis protease LBA 46 and commercial protease Alcalase 2.4L showed superior antioxidant activity for the responses evaluated by the ORAC and FRAP methods compared to unhydrolysed rice protein. Pea protein hydrolysates prepared with B. licheniformis protease LBA 46 and commercial protease Alcalase 2.4L showed antioxidant activity for all responses evaluated by the DPPH, ORAC and FRAP methods. The antioxidant activity of pea protein hydrolysates measured in terms of DPPH and FRAP was lower in comparison with the antioxidant activity of the non-hydrolyzed protein sample. However, the antioxidant activity measured in terms of the ORAC had a significant increase of 7.33 and 9.27 times for the LBA protease hydrolysates and for the Alcalase 2.4L hydrolysates, respectively, compared to the non-hydrolyzed protein.The hydrolysis conditions were validated and, in the condition selected as the most appropriate (pH 10 and 100 U/mL protease), it was possible to confirm that the defined models were predictive
Subject: Bacillus licheniformis
Fermentação
Homogeneização
Hidrólise
Peptídeos hidrolases
Language: Inglês
Editor: [s.n.]
Citation: SANTOS, Jessika Gonçalves dos. Protease from Bacillus licheniformis: production, purification, characterization and application of the enzyme in the hydrolysis of rice and pea proteins = Protease de Bacillus licheniformis: produção, purificação, caracterização e aplicação da enzima na hidrólise das proteínas de arroz e ervilha . 2017. 1 recurso online (182 p.) Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos, Campinas, SP. Disponível em: http://www.repositorio.unicamp.br/handle/REPOSIP/333279. Acesso em: 3 Jan. 2021.
Date Issue: 2017
Appears in Collections:FEA - Tese e Dissertação

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