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Type: TESE DIGITAL
Degree Level: Doutorado
Title: HIF-3alfa : estudos estruturais, identificação e caracterização de um inédito cofator celular dos fatores de transcrição induzíveis por hipóxia (HIF) e estudos estruturais das prolil-hidroxilases (PHDs) de organismos não usuais
Title Alternative: HIF-3alpha : structural studies, identification and characterization of a high-affinity ligand of hypoxia inducible factor (HIF) and structural studies of prolil-hydroxilases (PHDs) from non usual organisms
Author: Fala, Angela Maria, 1983-
Advisor: Ambrosio, Andre Luís Berteli
Abstract: Resumo: HIFs (Hypoxia inducible factors) são fatores de transcrição multidomínio, formados pelo heterodímero entre as subunidades alfa e beta. São conhecidas três isoformas para a subunidade alfa (HIF-1alfa, HIF-2alfa e HIF-3alfa), sob condições de normóxia todas as isoformas alfa sofrem regulação pós traducional sendo reguladas por uma família de hidroxilases, as PHDs (Prolil hidroxilases), as quais hidroxilam dois resíduos de prolina presente no domínio ODDD (domínio dependente de oxigênio), e subsequente levando a poli ubiquitinação destinando as subunidades alfa para degradação via proteossomo. As PHDs são hidroxilases dependentes de oxigênio, das quais são conhecidas quatro isoformas, e todas são capazes de hidroxilar as subunidades alfa das HIF e são, portanto, seu principal regulador. O complexo HIF-alfa e HIF-beta podem regular a transcrição de mais de 100 genes, dos quais muitos estão envolvidos no desenvolvimento e progressão do câncer, como a regulação de genes envolvidos em angiogênese, eritropoiese, proliferação celular e apoptose. A HIF-3alfa foi a última isoforma a ser descoberta entre as subunidades ?, e ela é distinta de várias maneiras em comparação às demais. Primeiro, o gene de codificação para HIF-3alfa (HIF3A) é regulado pela HIF-1alfa e é exclusivamente sujeito a splicing alternativo, com seis isoformas confirmadas em níveis proteicos, das quais o único domínio comum entre todas elas é o domínio Per-ARNT-Sim (PASb), que é responsável pela heterodimerização com a HIF-beta. Além disso, a ausência completa do domínio C-terminal (CTAD) leva a isoforma a ser a menor entre as isoformas alfa. Dada a importância das HIFs na biologia e progressão do câncer os objetivos deste trabalho foram estudar o domínio PASb da HIF-3alfa humana e as prolil hidroxilases de organismos não usuais. Objetivamos ainda produzir e realizar ensaios estruturais com a isoforma PASb-3alfa4 da HIF-3alfa, porém após diversas tentativas de expressão e purificação, a proteína continuou na forma insolúvel o que impossibilitou a continuidade dos estudos. Desta forma, apresentamos a estrutura cristalográfica do domínio PASb de HIF-3alfa na resolução de 1,15 Å, na qual identificamos uma cavidade hidrofóbica volumosa exclusiva com 510Å3 ligada ao ácido graxo insaturado cis-vaccenico de 18 carbonos como um inesperado e novo cofator intracelular para HIF-3alfa. Ensaios in vitro mostraram que a proteína é capaz de se ligar a diferentes tipos de lipídeos, os quais foram submetidos à análise por espectrometria de massas através da extração da fase orgânica da amostra. Foram identificados dois fosfolípideos como sendo uma liso-fosfoetanolamina 1-(11Z-octadecenol)-2-hidroxil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18: 1-LPE) e Liso-fosfoglicerol 1-(11Z-octadecenoil) -2-hidroxil-sn-glicerol-3-fosfo- (1'-sn-glicerol) (18:1-LPG). De modo a explorar a cavidade hidrofóbica e identificar outros lipídeos que possam se ligar a proteína, realizamos ensaio de delipidação e titulação de ácidos graxos livres com diferentes comprimentos da cadeia carbônica e níveis de insaturação, que pudessem estar presentes no organismo humano. Como resultado observamos uma alta afinidade com ácidos graxos oleico (18:1) e linoleico (18: 2) com kd de 39±1nM e 0,8±0,2 nM respectivamente. Estes resultados evidenciam que esta é a primeira vez que um domínio PAS eucariótico pode servir como um sensor para os níveis intracelulares de lipídeos, possivelmente ditando a expressão do gene dependente de HIF-3alfa em resposta a resultados biossintéticos e bioenergéticos, tais como acumulação ou depleção de lipídeos, em exposição à hipóxia. Apresentamos também os resultados da colaboração com o Dr. Christopher Schofield e seu grupo de trabalho (Chemistry Department-Oxford University), através de estudos estruturais das prolil hidroxilases (PHD1, 2 e 3) para os quais foram utilizados os genes presentes em organismos não convencionais, como morsa, ornitorrinco e python que apresentaram similaridade relativa em relação às hidroxilases humanas. Foram selecionados oito organismos, dos quais obtivemos proteínas solúveis para seis deles. Duas isoformas para a PHD3 (genes de ornitorrinco e python) se mostraram mais estáveis e foram purificadas com alto grau de pureza. Ambas as proteínas foram submetidas a teste de atividade enzimática utilizando peptídeos sintéticos da HIF-1?, onde observamos que as enzimas são ativas e hidroxilam preferencialmente à prolina contida no domínio CODD da HIF. Também foram realizados ensaios de biologia estrutural através da cristalização da PHD3 de python, o qual inicialmente apresentou a formação de esferulitas e após algumas otimizações, não obtivemos cristais únicos. Para as demais PHDs que foram obtidas na forma solúvel diversas otimizações nos protocolos de purificação tiveram de ser realizadas a fim de obter amostras mais estáveis e promissoras para os ensaios de cristalização e atividade enzimática

Abstract: HIFs (Hypoxia-inducible-factors) are heterodimers formed by subunits alpha and beta that regulate the transcription of more than 100 genes, of which are involved in the development and progression of cancer. Three isoforms for the alpha-subunit are known, and under normoxia conditions, they are regulated by PHDs (Prolyl hydroxylases) which lead to the hydroxylation of two residues of proline and subsequent assignment for degradation via the proteosome. PHDs are dioxygenases and the master regulator for HIFs. There are known four isoforms and all of them can hydroxylate the alpha subunits of HIF under normoxia. The complex of HIF-alpha:HIF-beta can regulate the transcription of more than 100 genes, many of them are involved in the development and progression of cancer, such as the regulation of genes involved in angiogenesis, erythropoiesis, cell proliferation and apoptosis. The subunit -3alpha is the last addition to the HIF-alpha class subunits (HIF-3alpha) and a distinctive one in a number of ways. Firstly, the gene encoding for HIF-3alpha (HIF3A) is itself under regulation of HIF-1alpha and exclusively subject to alternative splicing, with six isoforms confirmed by protein levels so far. Besides the complete absence of C-terminal (CTAD), HIF-3alpha is considered the short isoform in comparison with HIF-1alpha and -2alpha. Secondly, the only common domain between all -3alpha isoforms is the C-terminal Per-ARNT-Sim sensor domain (PASb), which is responsible for heterodimerization with HIF-beta. The aims of this project were to study the PASb domain of human HIF-3alpha and the prolyl hydroxylases of unusual organisms. We also intend to produce and perform structural assays with the PASb-3alpha4 isoform of HIF-3alpha, but after several attempts at expression and purification, the protein continued in the insoluble form, which made it impossible to continue the studies. Here we report the crystal structure of the PASb domain of HIF-3alpha at 1.15 Å maximum resolution and we identify an exclusive bulky hydrophobic cavity with 510Å3, bound to the unsaturated 18-carbon-long fatty acids as an unexpected and novel high-affinity intracellular cofactors of HIF-3alpha. The lipids were extracted from the samples and two phospholipids were identified by mass spectrometry as a Lysophosphoethanolamine 1-(11Z-octadecenoul)-2-hydroxil-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (18:1-LPE) and Lysophosphoglycerol 1-(11Z-octadecenoyl)-2-hydroxil-sn-glycerol-3-phospho-(1'-sn-glycerol) (18:1 LPG). To explore the hydrophobic cavity and identify other lipids that could be interacting with the protein, we performed delipidation assays and titration of free fatty acids with different sizes and insaturation that could be present in the human organism. The results showed a higher affinity with oleic and linoleic fatty acids (18:1 and 18:2 carbons) with kd of 39±1nM and 0,8±0,2 nM respectively. Overall, this is the first evidence that an eukaryotic PAS domain may serve as a sensor for the lipid levels of the cell, possibly dictating HIF-3alpha-dependent gene expression in response to biosynthetic and bioenergetic outcomes, such as lipid accumulation or depletion, upon exposure to hypoxia. We also planned to study the three prolyl hydroxylases (PHD1, 2 and 3) as a collaboration with Dr. Christopher Schofield and their group (Chemistry Department-Oxford University). The genes of organisms that contained the predicted sequences for these enzymes, such as walrus, platypus and python. Were selected eight organisms, from which we obtained soluble proteins for six of them. Two isoforms for PHD3 (platypus and python genes) were shown to be more stable and purified with high purity. As result of the enzymatic activity of PHD3 for python and platypus organisms, we observed that the enzymes are active and they preferentially hydroxylate the proline contained in the CODD domain of HIF. Upon crystallization assay of PHD3 from python, we obtained small malformed crystals and after some refinement cycles we did not obtain single crystals that could be taken to diffraction. For the remaining PHDs that were obtained in a soluble form, several optimizations on the purification protocols had to be made to obtain more stable and promising samples, so that crystallization and enzymatic activity assays can be performed
Subject: Fator induzível por hipoxia
Prolil hidroxilases
Ácidos graxos
Lipídeos
Cristalografia
Language: Português
Editor: [s.n.]
Citation: FALA, Angela Maria. HIF-3alfa: estudos estruturais, identificação e caracterização de um inédito cofator celular dos fatores de transcrição induzíveis por hipóxia (HIF) e estudos estruturais das prolil-hidroxilases (PHDs) de organismos não usuais. 2017. 1 recurso online (125 p.). Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP.
Date Issue: 2017
Appears in Collections:IB - Tese e Dissertação

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