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Type: TESE DIGITAL
Degree Level: Doutorado
Title: Descobrimento de candidatos a novos fármacos para tratamento da leishmaniose visceral   : do desenvolvimento de um ensaio baseado em imagem à triagem de compostos em modelos in vitro = Discovery of new drugs candidates for visceral leishmaniasis treatment: from image-based assay development to in vitro compounds screening    
Title Alternative: Discovery of new drugs candidates for visceral leishmaniasis treatment   : from image-based assay development to in vitro compounds screening  
Author: Alcântara, Laura Maria, 1988-
Advisor: Freitas-Junior, Lucio Holanda
Abstract: Resumo: As leishmanioses são doenças negligenciadas causadas por protozoários do gênero Leishmania, que provocam grande impacto na saúde pública de países em desenvolvimento. A quimioterapia disponível ainda é limitada e apresenta importantes limitações; portanto, é prioritária a pesquisa e descoberta de novos fármacos com potencial leishmanicida. Nesse contexto, os ensaios de alto conteúdo (HCS) vem sendo empregados eficientemente nas fases iniciais do desenvolvimento de fármacos, para identificação de moléculas candidatas com atividade anti-Leishmania. Apesar das vantagens, essa metodologia ainda apresenta baixas taxas de hits e de confirmação, quando comparada a modelos de outras doenças, e alta taxa de falhas quando os compostos são testados em modelos in vivo. Além disso, os protocolos de HCS vem sendo empregados para um número limitado de cepas de Leishmania, geralmente L. donovani, embora espécies/cepas possam diferir drasticamente em termos de infecção e suscetibilidade aos fármacos. Dessa forma, focado em protocolos de HCS previamente publicados, um ensaio baseado em imagem foi desenvolvido e otimizado, para a triagem de compostos contra amastigotas intracelulares de diferentes cepas/espécies viscerais de Leishmania. Para cada espécie/cepa, estabeleceu-se o modelo biológico, determinando-se as melhores condições de cultivo para célula hospedeira e parasita, infecção e período de exposição aos compostos, e padronizou-se o método de análise de imagem através do software comercial. Entre as cepas/espécies estabelecidas, houve diferenças no perfil de infecção, em termos de taxa de infecção, número de parasitas intracelulares e taxa de multiplicação celular; bem como na atividade de compostos referência: enquanto a anfotericina B apresentou atividade consistente contra as cepas, a miltefosina mostrou atividade dependente da cepa, com valores de EC50 entre 0,4 e 7,6 µM. O mesmo perfil de variação dependente da cepa ocorreu na dinâmica de atividade dos compostos referência, na triagem de bibliotecas e na atividade dos hits selecionados; evidenciando, assim, a importância da expansão do portfólio de ensaios in vitro para Leishmania. Através da metodologia estabelecida, a prospecção de candidatos a fármacos foi realizada, utilizando diferentes abordagens: triagem de bibliotecas de extratos naturais e compostos sintéticos, reposicionamento de fármacos e combinação terapêutica. Destacam-se os resultados obtidos através: (i) da biblioteca Hypha Mycodiverse, da qual foram identificados cinco compostos purificados com atividade anti-Leishmania promissora (EC50 ? 1,3 µM), (ii) das coleções de compostos/extratos de diferentes colaboradores, com classes terapêuticas e químicas inéditas ou pouco exploradas, tais como marinoquinolinas, chalconas e belzil-farnesil aminas, e candidatos potenciais (EC50 < 10 µM), representando moléculas e scaffolds iniciais para otimização química, (iii) da biblioteca comercial LOPAC, da qual o composto nitro CB1954 apresentou atividade de amplo espectro: contra as diferentes cepas e formas do ciclo de vida do parasita e contra outros tripanossomatídeos, com valores de EC50 na grandeza de nano e micro molar, e (iv) da combinação terapêutica, na qual o inibidor de calpaína MDL28170 apresentou perfil sinérgico em associação com anfotericina e miltefosina. Conclui-se que a metodologia estabelecida representa uma importante contribuição para os processos iniciais do desenvolvimento de fármacos, sendo que os candidatos identificados nesse trabalho poderão ser explorados futuramente como alternativa de terapia para leishmanioses

Abstract: Leishmaniasis are neglected diseases caused by protozoan parasites of genus Leishmania, which lead to severe impact in public health of developing countries. The available chemotherapy is still inadequate and presents important limitations; therefore, the research and the discovery of new leishmanicidal drugs must be prioritized. In this context, the high content screenings (HCS) have been applied efficiently in the early drug development, for identification of candidate molecules with anti-Leishmania activity. Despite the advances, the methodology still has several drawbacks such as low ratio of hits and confirmation, compared to others diseases models, and high number of failures, when compounds are assessed in in vivo assays. Additionally, HCS protocols have been developed, to the date, for a limited number of Leishmania species, mostly L. donovani, although different species/strains may diverge dramatically in regard to drug susceptibility. Therefore, focused on HCS protocols previously published, an image-based assay was developed and optimized, in order to screen compounds against intracellular amastigotes of distinct Leishmania species and strains. For each species/strains, the biological model was established by determining the best conditions of host cell and parasite culture, infection and period of drug exposition; and an image analysis method was standardized using a commercial software. Among the strains/species established, differences were observed in the general infection parameters, in terms of infection ratio, intracellular amastigotes number and multiplying amastigotes ratio; also, diverging results were verified for reference compounds activity: while amphotericin B presented consistent activity against strains, miltefosine showed strain-dependent activity, with EC50 values from 0.4 to 7.6 µM. The strain-specific profile also occurred in the activity dynamics of reference compounds, in libraries screening and in the activity of selected hits, confirming the importance of expanding the in vitro Leishmania portfolio. Throughout this methodology, candidates¿ prospections were performed within different screening approaches: triage of libraries containing natural products and synthetic compounds, drugs repurposing and drugs combination. Among the results, we highlight: (i) Hypha Mycodiverse library, from which we identified five purified compounds with promising anti-Leishmania activity (EC50 ? 1.3 µM), (ii) Compounds and extracts collections from collaborators, from which we discovered new chemical and therapeutic classes, such as marinoquinolines, chalcones and belzil-farnesil amines, and potential candidates (EC50 < 10 µM), representing molecules and scaffolds for chemical optimization, (iii) LOPAC library screening, from which we selected the nitro compound CB1954, that presented a broad-spectrum activity: against distinct strains and life cycle forms of Leishmania and others trypanosomatids, with EC50 values from nano to micro molar and (iv) drugs combination, in which the calpain inhibitor MDL28170 present synergic effect in association with amphotericin B and miltefosine. We concluded that this novel methodological approach represents an important contribution for early stage anti-Leishmania drug discovery and the candidates identified can be further explored as an alternative for leishmaniasis therapy
Subject: Leishmania
Leishmaniose visceral
Ensaios de triagem em larga escala
Descoberta de drogas
Language: Português
Editor: [s.n.]
Citation: ALCÂNTARA, Laura Maria. Descobrimento de candidatos a novos fármacos para tratamento da leishmaniose visceral  : do desenvolvimento de um ensaio baseado em imagem à triagem de compostos em modelos in vitro = Discovery of new drugs candidates for visceral leishmaniasis treatment: from image-based assay development to in vitro compounds screening    . 2017. 1 recurso online (212 p.). Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP.
Date Issue: 2017
Appears in Collections:IB - Tese e Dissertação

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