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Type: TESE DIGITAL
Degree Level: Doutorado
Title: Estudo proteômico e ionômico para identificação de biomarcadores em amostras de fluidos biológicos de pacientes com transtornos psiquiátricos e indivíduos saudáveis   : do preparo de amostra à quantificação  
Title Alternative: Proteomic and ionomic study for identification of biomarkers in biological fluid samples of patients with psychiatric disorders and healthy individuals   : from sample preparation to quantification  
Author: Jesus, Jemmyson Romário de, 1989-
Advisor: Arruda, Marco Aurelio Zezzi, 1965-
Abstract: Resumo: O transtorno afetivo bipolar (TAB) é uma doença psiquiátrica caracterizada por alterações de humor que afeta milhares de pessoas no mundo. A escassez de conhecimentos científicos acerca de sua patogênese faz do TAB uma doença de complexa e de difícil diagnóstico. Alguns pacientes portadores do TAB são, por exemplo, diagnosticados equivocadamente como depressivos unipolares e, como consequência, são tratados ineficazmente. Diante desse fato, uma análise exploratória utilizando estratégias ômicas (proteômica e ionômica) comparativas no soro sanguíneo de pacientes com TAB, controles saudáveis, incluindo não familiares (CSNF) e familiares (CSF), pacientes com esquizofrenia (ESQ) e pacientes com outros transtornos mentais (OTM) foi realizado, a fim de determinar potenciais marcadores biológicos do TAB. Para o estudo proteômico, três métodos foram avaliados para simplificar o proteoma do soro sanguíneo: depleção de proteínas abundantes usando agentes químicos (acetonitrila, ACN; e ditiotreitol, DTT) em sequência; depleção de proteínas abundantes, usando nanopartículas magnéticas (MNPs) e a equalização de proteínas usando kit comercial ProteoMiner® (PM). Para o estudo ionômico, dois métodos foram testados para a decomposição da amostra: decomposição assistida por microondas (método convencional) e decomposição rápida assistida por ultrassom de alta potência (método proposto). Como resultado do estudo proteômico, o método PM apresentou-se como a melhor estratégia para remover as proteínas de alta abundância. Por meio da comparação de imagens de géis 2-D DIGE, 37 spots de proteínas foram encontrados como diferencialmente abundantes (p <0,05, teste t de Student), que exibiram variação do fator de regulação ? 2 vezes o valor médio das intensidades dos spots do soro de pacientes ESQ, TAB e OTM em comparação aos controles (CSF e CSNF). A partir desses spots detectados, foram identificadas 13 diferentes proteínas: ApoA1, ApoE, ApoC3, ApoA4, Samp, SerpinA1, TTR, IgK, Alb, VTN, TR, C4A e C4B. Como resultado do estudo ionômico, o método proposto usando ultrassom apresentou as melhores condições para a extração de Zn, Cu, Fe, Li, Cd e Pb do soro sanguíneo. A partir da aplicação do método proposto, as recuperações dos analitos variaram entre 80 a 121%, com desvio padrão relativo variando entre 3-10% (n=3). Assim, a aplicação das condições ótimas (40%(v/v) de HNO3 + 30%(v/v) de HCl como componentes da solução extratora, 60% como amplitude de sonicação e 3 min como tempo ótimo de sonicação) foram aplicadas nas amostras de soro de TAB, ESQ, e indivíduos saudáveis, onde observou-se a ausência de Pb e Cd para todas as amostras avaliadas, e diferenças significativas na concentração de Zn, Cu, Li e Fe entre os grupos avaliados. Para o grupo dos indivíduos com o diagnóstico de TAB, um alto nível da concentração dos metais foi observado, enquanto que para o grupo de ESQ, todos os metais foram encontrados em baixos níveis, quando comparados com os indivíduos saudáveis. Além disso, uma nova metodologia foi desenvolvida baseada em membrana polimérica a fim de extrair a totalidade das proteínas presentes em amostras de urina livres de interferentes, permitindo caracterizar o proteoma urinário com o objetivo de descobrir biomarcadores de doenças humanas. Nesse estudo, após otimização de alguns parâmetros, tais como composição da membrana polimérica (celulose, acetato de celulose, nitrocelulose), tamanho do poro da membrana (0,22 e 0,45 µm), vazão da urina (0,25, 0,5 e 1 mL -1) e pH do meio (3, 4, 5, 6, e 7), foi observado melhores resultados usando membrana de nitrocelulose, com um tamanho de poro de 0,22 µm, e vazão de urina de 0,25 mL min-1, além de usar um pH 3 para obter uma retenção de proteína urinária na membrana superior a 90%. Além disso, a metodologia desenvolvida foi aplicada a um estudo de classificação de gênero, a fim de avaliar uma diferenciação proteômica de gênero (masculino e feminino). Como resultado, uma classificação significativa foi obtida, de acordo com os dados obtidos por análise de componente principal (PCA) e hierarquical clastering, bem como vulcano plot e os gráficos de intersecção

Abstract: Bipolar disorder (BD) is a psychiatric disorder characterized by mood alteration that affects thousands of people around the world. The little scientific knowledge about its pathogenesis, become BD a complex disease, and with hard diagnosis. Some patients with BD are, for example, misdiagnosed as unipolar depressives and, as a consequence, they are undergoing ineffective treatments. Thus, an exploratory analysis using strategies omics (proteomic and ionomic) in the blood serum of patients with BD, healthy controls, including nonfamily (HCNF) and familial (HCF), patients with schizophrenia (SCH) and patients with other mental disorders (OTM) were compared in order to determine potential biological markers of BD. For the proteomic study three methods were evaluated to simplify the blood serum proteome: sequential depletion of abundant proteins using chemical agents (acetonitrile, ACN, and dithiothreitol, DTT); abundant protein depletion using magnetic nanoparticles (MNPs) and the equalization of proteins using commercial ProteoMiner (PM) kit. For the ionomic study, two methods were tested for the decomposition of the sample: microwave assisted decomposition (conventional method); and fast decomposition assisted by high power ultrasound (proposed method). As a result of the proteomic study, the PM method was the best strategy to remove high abundance proteins. By comparing 2D-DIGE gel images, 37 protein spots were found to be differentially abundant (p <0.05, Student's t-test), which exhibited a variation in the regulation factor ? 2 times the mean value of the intensities of serum spots of ESQ, TAB and OTM patients compared to controls (HCF and HCNF). From these detected spots, 13 different proteins were identified: ApoA1, ApoE, ApoC3, ApoA4, Samp, SerpinA1, TTR, IgK, Alb, VTN, TR, C4A and C4B. As a result of the ionomic study, the method proposed using ultrasound presented the best conditions for the extraction of Zn, Cu, Fe, Li, Cd and Pb from serum. From the application of the proposed method, the recoveries of the analytes varied between 80 to 121%, with relative standard deviation varying between 3-10%. Thus, the application of the optimal conditions (40% (v/v) of HNO3 + 30% (v/v) HCl as components of the extractive solution, 60% as the sonication amplitude and 3 min as the optimal sonication time) in the serum samples from TAB, ESQ, and healthy individuals, where the absence of Pb and Cd was observed for all the samples evaluated and significant differences in the concentration of Zn, Cu, Li and Fe among the groups evaluated. To TAB group, the metals were observed at a high level, while for the ESQ group, all metals were found at low levels when compared to healthy individuals. In addition, as a result of the study during the sandwich period, a new methodology was developed based on polymer membrane in order to extract all the proteins present in urine samples interferents-free, allowing to characterize the proteome of urine with the objective of discovering biomarkers of human diseases. In this study, after optimization of some parameters, such as polymer membrane composition (cellulose, cellulose acetate, nitrocellulose), membrane pore size (0.22 and 0.45 ?m), urine flow rate (0.25, 5 and 1 mL -1) and pH of the medium (3, 4, 5, 6, and 7), it was observed that the best results were obtained using nitrocellulose membrane, with a pore size of 0.22 ?m and urine of 0.25 mL min-1, in addition to using a pH of 3 to obtain a retention of membrane urinary protein greater than 90%. In addition, the methodology developed was applied in a gender classification study, in order to evaluate a gender-based proteomic differentiation (male and female). As a result, a significant classification was obtained, according to data obtained by principal component analysis (PCA) and hierarchical clastering, as well as vulcano plot and intersection plots
Subject: Proteômica
Ionômica
Preparo de amostra - Química
Marcadores biológicos
Psiquiatria - Doenças
Language: Português
Editor: [s.n.]
Citation: JESUS, Jemmyson Romário de. Estudo proteômico e ionômico para identificação de biomarcadores em amostras de fluidos biológicos de pacientes com transtornos psiquiátricos e indivíduos saudáveis  : do preparo de amostra à quantificação  . 2018. 1 recurso online (147 p.). Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química, Campinas, SP. Disponível em: <http://www.repositorio.unicamp.br/handle/REPOSIP/331819>. Acesso em: 3 set. 2018.
Date Issue: 2018
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