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Type: TESE DIGITAL
Degree Level: Doutorado
Title: Emprego de estratégias ômicas na avaliação de plantas de soja transgênica e não-transgênica após cultivo com nanopartículas de prata
Title Alternative: Omic strategies in the evaluation of transgenic and non-transgenic soybean plants after cultivation with silver nanoparticles
Author: Galazzi, Rodrigo Moretto, 1988-
Advisor: Arruda, Marco Aurelio Zezzi, 1965-
Abstract: Resumo: Inicialmente, todo um estudo acerca da caracterização e quantificação das nanopartículas de prata (AgNP) foi realizado a fim de se avaliar a concentração de prata (Ag) tanto nas AgNP após a síntese, quanto nas suas frações (AgNP-res e Ag-sob). Com esta abordagem, observou-se que aproximadamente 50% da Ag está na forma de nanopartículas (NPs) na solução de AgNP após a síntese, enquanto os outros 50% da Ag está na forma livre iônica. Tais resultados sugerem que, para estudos sobre a aplicação das AgNPs, é necessária a purificação das mesmas via centrifugação e remoção do sobrenadante (Ag-sob), para que apenas a fração AgNP-res, que contém as NPs, seja empregada. Se essa estratégia não for considerada e a solução após a síntese for diretamente utilizada, possivelmente, os efeitos observados em um estudo serão sinérgicos devido à presença das NPs e da Ag livre na solução após a síntese. Após a avaliação das AgNP a serem empregadas neste estudo, foi realizado um cultivo-teste com uma concentração final de 250 mg kg-1 de Ag no substrato. Nestas condições, ambas as plantas não-transgênicas e transgênicas não sobreviveram ao cultivo com o nitrato de Ag (AgNO3), indicando que as plantas interagem de maneira distinta com as diferentes formas de Ag. Por isso, todos os demais cultivos foram realizados com uma concentração final de 50 mg kg-1 de Ag no substrato. Então, um estudo proteômico por 2-D DIGE foi realizado e diversos spots diferenciais foram encontrados entre as plantas de soja NT e T dos grupos controle e as plantas cultivadas com as AgNP e AgNO3. As plantas de soja NT e T apresentaram um comportamento distinto, em termos de spots diferenciais, uma vez que as plantas NT foram mais afetadas pelo cultivo com o AgNO3, enquanto que as plantas T foram mais sensíveis ao tratamento com as AgNPs, inclusive com um incremento significativo (teste de Tukey - p < 0,05) na quantidade total de proteínas nas folhas de soja. Após os resultados obtidos pela técnica de 2-D DIGE, os estudos proteômicos foram finalizados com a identificação, por espectrometria de massas, daquelas proteínas presentes nos spots diferenciais entre os grupos controle e os cultivados com as AgNP e AgNO3. De maneira geral, independente da forma de Ag empregada no cultivo, ambas as variedades de soja, NT e T, estão sob condição de estresse, uma vez que algumas proteínas relacionadas à tal condição foram identificadas, dentre elas a ribulose. Além da ribulose, espécies como a superóxido dismutase, ATP synthase, triosephosphate isomerase, entre outras, foram identificadas dentre os grupos de soja NT e T tratadas, sugerindo que os cultivos com AgNO3 e AgNP, possivelmente, resultaram em uma condição de estresse oxidativo. Adicionalmente, foi realizado um estudo enzimático com a finalidade de ampliar o entendimento do estresse oxidativo causado pelos cultivos com AgNO3 e AgNP observado nos estudos proteômicos. Enzimas como a catalase (CAT) e a superóxido dismutase (SOD), bem como o conteúdo de H2O2 e malondialdeído (MDA) foram avaliados, confirmando que as plantas de soja NT e T cultivadas com as AgNP e AgNO3 estão sob condição de estresse. Todos os resultados obtidos por meio de uma abordagem proteômica e avaliação enzimática sugerem que, de fato, a resposta de uma planta, em termos de ROS, conteúdo e atividade das enzimas antioxidantes, sob condições de estresse oxidativo, é dependente de vários fatores, dentre eles a espécie de planta estudada (no nosso caso, da variedade) e do tipo de metal/metalóide ou NPs empregados durante o cultivo. Com relação à absorção e assimilação de Ag, de maneira geral, as plantas de soja T translocaram uma maior quantidade de Ag em comparação com a soja NT. Considerando os diferentes tratamentos, independente da variedade de soja, o cultivo com AgNP resultou em uma maior taxa de translocação. Considerando o estudo ionômico, diferenças significativas (p ? 0,05) em termos de macro e micronutrientes foram encontradas em todos os compartimentos, principalmente nas raízes. Sendo assim, a presença de Ag, elemento não essencial para a bioquímica das plantas, em suas distintas formas (AgNP e AgNO3) interfere na absorção de alguns nutrientes. Tal fato pode estar relacionado com condições de estresse e consequente formação de clorose nas folhas das plantas, como observado em nosso estudo. Adicionalmente, foi observada a formação de necrose na parte basal do caule das plantas NT e T expostas às AgNP ou AgNO3. Por fim, o emprego de tampões extratores brandos e estratégias hifenadas baseadas em cromatografia líquida acoplada a ambas as técnicas ICP-MS e ESI-Orbitrap foram consideradas na avaliação de complexos metálicos que possam estar alterados nas folhas de soja NT e T devido aos cultivos com AgNP ou AgNO3. Após a obtenção de perfis de SEC-ICP-MS, diferenças em termos de intensidade foram observadas para Mn, Fe, Zn e Cu entre os grupos controle e tratados. Então, das quatro frações encontradas em SEC-ICP-MS, a fração três (F3) foi considerada e analisada por HILIC-ICP-MS em que perfis para Fe, Zn e Cu, previamente monitorados por SEC-ICP-MS, foram também obtidos. Então, a mesma fração F3 foi analisada por HILIC-ESI-Orbitrap e alguns íons com padrões isotópicos para Cu e Zn foram encontrados. Tais íons foram selecionados para futuros experimentos de fragmentação por HILIC-ESI-Orbitrap no modo tandem. Com tais resultados, espera-se identificar as espécies metálicas e, consequentemente, as possíveis vias que possam estar alteradas nas plantas de soja NT e T devido aos cultivos com AgNP e AgNO3

Abstract: Initially, a study concerning characterization and quantification of silver nanoparticles (AgNP) was performed to evaluate silver (Ag) concentration in AgNP after the synthesis, as well as in its fractions (AgNP-res and Ag-sup ). According to results, approximately 50% of Ag is in the form of nanoparticles (NPs) in the AgNP solution after the synthesis, while the other 50% of Ag is in the ionic free form. These results suggest that, for studies related to AgNP application, is necessary to purify them by centrifugation and removal of the supernatant (Ag-sup), so that only the AgNP-res fraction containing NPs will be used. If this strategy is not considered and the solution after the synthesis is directly employed, possibly the effects observed in a study will be synergistic due to the presence of both NPs and free Ag in the solution after the synthesis. After the evaluation of AgNP to be used in this study, a cultivation test was first carried out with a final concentration of 250 mg kg-1 of Ag in the substrate. Under these conditions, both non-transgenic (NT) and transgenic (T) soybean plants did not survive to the cultivation with Ag (AgNO3) nitrate, indicating that the plants interacted differently with the different forms of Ag. Then, for a comparative evaluation, cultivations with final concentration of 50 mg kg-1 Ag on the substrate were carried out. Then, a proteomic study by 2-D DIGE was performed and several differentially abundant spots were found between NT and T soybeans from control groups and those plants which grown in the presence of AgNP or AgNO3. NT and T plants showed a different behavior in terms of differential spots, since NT soybeans were more affected by the cultivation with AgNO3, whereas T plants were more sensitive to the treatment with AgNP, including a significant increase (Tukey test - p < 0.05) in the total amount of proteins in soybean leaves. Then, the proteomic evaluation was finalized with the identification, by mass spectrometry, of those proteins present in the differential spots between the control groups and those which were exposed to AgNP or AgNO3. In general, regardless of the Ag form used in the cultivation, both soybean varieties are under stress condition, since some proteins related to such condition have been identified, among them ribulose. In addition to ribulose, species such as superoxide dismutase, ATP synthase, triosephosphate isomerase, among others, were identified in treated NT and T soybean groups, suggesting that the cultivation with AgNP and AgNO3 possibly resulted in an oxidative stress condition. Additionally, an enzymatic study was performed to increase the understanding regarding oxidative stress caused by AgNP and AgNO3 cultivations, previously observed in the proteomic evaluation. Enzymes such as catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD), as well as the content of H2O2 and malondialdehyde (MDA) were assessed, confirming that NT and T plants exposed to AgNP and AgNO3 are under stress conditions. All the results obtained through a proteomic and enzymatic approaches suggest that, in fact, the response of a plant, in terms of reactive oxygen species, content and activity of antioxidant enzymes, under oxidative stress conditions, is dependent on several factors, among them the plant species studied (in our case the variety) and the type of metal/metalloid or NPs used during cultivation. Regarding the uptake and assimilation of Ag, in general, T soybeans translocated a greater amount of Ag when compared to NT plants. Considering the different treatments, regardless of the soybean variety, the cultivation with AgNP resulted in a higher translocation rate. Through ionomic evaluation, significant differences (p ? 0.05) in terms of macro and micronutrients were found in all compartments, especially in the roots. Therefore, the presence of Ag, a non-essential element for the plant biochemistry, in its different forms (AgNP and AgNO3) interferes with the absorption of some nutrients. This fact may be related to stress conditions and consequent formation of chlorosis in the leaves of those treated plants, as observed in our study. Additionally, necrosis formation in the basal part of stems was observed for NT and T plants exposed to AgNP or AgNO3. Finally, the utilization of mild extractor buffers and hyphenated strategies based on liquid chromatography coupled to both ICP-MS and ESI-Orbitrap techniques were considered in the evaluation of metal species that may be altered in NT and T soybean leaves due to the cultivation with AgNP or AgNO3. After obtaining SEC-ICP-MS profiles, changes in the signal intensity were observed for Mn, Fe, Zn and Cu between control and treated groups. Then, from the four fractions found in SEC-ICP-MS, fraction three (F3) was only considered and analyzed by HILIC-ICP-MS. Profiles for Fe, Zn and Cu, previously monitored by SEC-ICP-MS, were also obtained. Then, the same F3 fraction was evaluated by HILIC-ESI-Orbitrap and some ions with isotopic patterns, mainly Cu and Zn, were found. These ions were selected for future HILIC-ESI-Orbitrap fragmentation experiments in tandem mode. With such results, it is expected to identify metal species and, consequently, provide additional information regarding possible pathways that may be altered in NT and T soybean plants due to AgNP and AgNO3 cultivations
Subject: Soja
Nanopartículas de prata
Ômicas
Espectrometria de massas
Editor: [s.n.]
Citation: GALAZZI, Rodrigo Moretto. Emprego de estratégias ômicas na avaliação de plantas de soja transgênica e não-transgênica após cultivo com nanopartículas de prata. 2017. 1 recurso online (172 p.). Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química, Campinas, SP. Disponível em: <http://www.repositorio.unicamp.br/handle/REPOSIP/330492>. Acesso em: 2 set. 2018.
Date Issue: 2017
Appears in Collections:IQ - Tese e Dissertação

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