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Type: TESE DIGITAL
Degree Level: Doutorado
Title: Estrutura, conformação e inibição de quinases de Leishmania = Structure, conformation and inhibition of kinases from Leishmania
Title Alternative: Structure, conformation and inhibition of kinases from Leishmania
Author: Vieira, Plínio Salmazo, 1985-
Advisor: Murakami, Mário Tyago
Abstract: Resumo: Quinases são enzimas fundamentais em muitos aspectos do metabolismo, da regulação gênica e da transmissão de sinais na célula. Parasitas intracelulares unicelulares podem fazer uso dessas proteínas em diversas funções, como divisão, sinalização e em sua interação com o hospedeiro. Em especial, o parasita Leishmania, causador da leishmaniose em diversas partes do mundo, é de grande interesse. Neste contexto, o entendimento de proteínas que participam de suas vias metabólicas, muitas das quais as quinases estão envolvidas, pode trazer benefícios para o controle e erradicação da doença, onde o número de novos casos é de cerca de um milhão e meio de pessoas, colocando em risco outras trezentos e dez milhões. Neste trabalho, foram estudadas duas quinases: as NEK quinases e as Nucleosídeo Difosfato Quinases. As NEK quinases são Ser/Thr quinases com funções relacionadas primariamente à cílios e flagelos, com grande expansão em organismos que possuem estas estruturas ligadas à divisão celular, como é o caso da Leishmania. A análise filogenética e de domínios mostrou que muitas NEKs são exclusivas do parasita, enquanto outras são próximas do hospedeiro humano. Uma construção da NEK LbrM.21.1750, dentre 21 iniciais que foram testadas sob 210 condições de expressão, foi purificada de forma eficiente e em quantidades suficientes para estudos estruturais. Apesar dos esforços empregados na cristalização, a proteína mostrou-se recalcitrante a este processo, o que impediu a elucidação da estrutura a alta resolução. Entretanto, o envelope de baixa resolução gerado pelos dados de SAXS corroborou com a estrutura tridimensional gerada pela modelagem por homologia. Ensaios de DSF com a LbrM.21.1750 selecionaram três compostos análogos ao ATP, dos quais apenas um (NU6140) pôde ser utilizado nos experimentos de cinética devido às condições de sais empregadas, com a molécula sendo caracterizada como um inibidor competitivo. As três moléculas foram testadas in vitro em culturas de Leishmania braziliensis, sendo ativas sobre as formas promastigota e amastigota do parasita, com exceção da molécula PD153035, que possivelmente não penetrou a membrana do macrófago. Deste modo, foram identificadas três possíveis novas moléculas através da NEK quinase que podem ser utilizadas como modelos iniciais para o desenvolvimento de novas drogas. A outra proteína estudada, NDK, é importante na manutenção dos níveis intracelulares de NTPs e NDPs, entre outras funções inclusive extracelulares, já que foi encontrada como sendo secretada por espécies de Leishmania. A NDK de L. braziliensis e as formas mutantes P95S, 'delta'5Cterm e P100S-'delta'5Cterm da NDK de Leishmania major foram purificadas em grandes quantidades e cristalizadas, tendo sua estrutura tridimensional posteriormente resolvida. Os envelopes de SAXS mostraram que, com exceção da proteína mutante P100S-'delta'5Cterm que é um dímero, todas as outras são hexamérica. Através de um estudo estrutural comparativo entre as proteínas nativas de L. braziliensis e L. major e as formas mutantes da última, foi possível notar a importante influência da região C-terminal desta enzima, com impacto em sua correta oligomerização e, por consequência, em sua atividade total. Deste modo, demonstrou-se que a região possui potencial como alvo para inibição da enzima, já que altera não só sua estrutura quaternária, como também sua função. Coletivamente, os estudos de ambas proteínas fornecem novas informações a respeito do repertório de quinases destes parasitas e trazem potenciais estratégias para sua inibição e consequente desenvolvimento de novas terapias

Abstract: Kinases are key enzymes in many aspects of cellular metabolism, gene regulation and signal transmission in the cell. Unicellular intracellular parasites can make use of these proteins in various functions such as division, signaling and its interaction with the host. In particular, the Leishmania parasite that causes leishmaniasis in different parts of the world, is of great interest. In this respect, the understanding of proteins that participate in their metabolic pathways, many of which kinases are involved, can bring benefits for the control and eradication of the disease, where the number of new cases is about a million and a half people, endangering other three hundred and ten million. In this work, we studied two classes of kinases: the NEK kinases and nucleoside diphosphate kinases. The NEK kinases are Ser/Thr kinases with functions related primarily to the cilia and flagella with large expansion in these organisms, as in the case of Leishmania. Phylogenetic analysis showed that many NEKs are unique to the parasite, while others are close to the human host. A construction NEK LbrM.21.1750 among the initial 21 to 210 residues were tested under conditions of expression, purified efficiently and in sufficient quantities for structural and biochemical assays. Despite extensive efforts employed in an attempt to crystallization, the protein proved recalcitrant to formation of crystals. However, the low resolution three dimensional structure was obtained from the SAXS data, indicating a good spatial correlation with the atomic coordinates generated by molecular modeling by homology. Extrinsic fluorescence assays revealed three analog compounds that bind to the ATP pocket of this kinase, of which NU6140 compound was used in kinetic experiments, being a competitive inhibitor. The three molecules were tested in vitro, being active on the promastigote and amastigote forms of the parasite, except PD153035 molecule that possibly did not penetrate the membrane of the macrophage. Thus, new molecules were identified through studies of the NEK kinases that can be used as starting templates for the development of new drugs. The other protein studied, NDK, is important in the maintenance of intracellular levels of NTPs and NDPs, among other functions including some extracellular, as it was found to be secreted by Leishmania species. The L. braziliensis NDK and mutant forms P95S, 'delta'5Cterm and P100S-'delta'5Cterm of Leishmania major NDK were purified and crystallized, and it was possible to resolve the three-dimensional structure. SAXS envelopes have shown that, with the exception of P100S-'delta'5Cterm mutant protein which is a dimer, all others are hexameric. Through a comparative structural study of the native proteins of L. braziliensis, L. major and mutant forms of the latter, it was possible to notice the important influence of the C-terminal region of this enzyme, affecting their correct oligomerization and therefore in its enzymatic activity. Thus, it was demonstrated that this region has potential as a target for enzyme inhibition since it alters not only its quaternary structure, but as well as their function.Collectively, the studies of both proteins provide new biochemical and structural insights about the kinase's repertoire of these parasites and bring potential strategies for inhibition and the consequent development of new therapies
Subject: Cristalografia
Editor: [s.n.]
Citation: VIEIRA, Plínio Salmazo. Estrutura, conformação e inibição de quinases de Leishmania = Structure, conformation and inhibition of kinases from Leishmania. 2016. 1 recurso online (243 p.). Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: <http://www.repositorio.unicamp.br/handle/REPOSIP/325758>. Acesso em: 31 ago. 2018.
Date Issue: 2016
Appears in Collections:IB - Tese e Dissertação

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