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Type: TESE DIGITAL
Degree Level: Doutorado
Title: A descoberta da interação entre miosina Va e RPGRIP1L = caracterização do complexo e localização no centrossomo = The discovery of the interaction between myosin Va and RPGRIP1L: characterization of the complex and localization at the centrosome
Title Alternative: The discovery of the interaction between myosin Va and RPGRIP1L : characterization of the complex and localization at the centrosome
Author: Assis, Leandro Henrique de Paula, 1986-
Advisor: Murakami, Mário Tyago
Abstract: Resumo: A miosina Va (MioVa) humana é uma proteína motora dimérica que utiliza a energia liberada pela hidrólise do ATP para se mover ao longo dos filamentos de actina. Sua principal função está relacionada ao transporte de cargas na célula, as quais compreendem vesículas, organelas, RNA mensageiro e proteínas regulatórias. Para que este ocorra, as cargas são ancoradas ao domínio de ligação a cargas (CBD) localizado na extremidade C-terminal da miosina. Normalmente, a ligação não ocorre de modo direto, mas é mediada por proteínas parceiras, algumas vezes também chamadas adaptadoras, as quais estão localizadas na superfície da carga. Por esse motivo, mutações nos genes que codificam a MioVa ou uma de suas proteínas parceiras estão associadas à patologias, incluindo a síndrome de Griscelli tipo 1, caracterizada por albinismo e problemas neurológicos. Embora a MioVa seja alvo de intenso estudo, ainda são poucas as proteínas parceiras descritas, dificultando a compreensão de vários processos celulares que dependem desse motor molecular. Para suprir essa carência, nós buscamos novos parceiros de interação para a MioVa através de screening em biblioteca de cDNA de cérebro fetal humano através de duplo-híbrido. Após a etapa de validação, nós selecionamos a proteína RPGRIP1L como alvo dos nossos estudos. A RPGRIP1L é uma proteína multidomínio que faz parte do sistema cílio-centrossomo, sendo importante para a formação da zona de transição na base do cílio primário, organela envolvida na captação de uma ampla variedade de sinais extracelulares. Usando ensaios de GST-pull down e termoforese em microescala nós mostramos que a MioVa-CBD se liga aos domínios C2 da RPGRIP1L com baixa afinidade (KD entre 3 e 9 µM), o que é típico de interações transientes entre proteínas. Além do mais, nossos resultados de duplo-híbrido usando mutações pontuais na superfície da MioVa-CBD indicaram que os resíduos W1713, Y1721, Q1755 e F1792 fazem parte do sítio de reconhecimento da RPGRIP1L. Estes resíduos são totalmente conservados na MioVb, e nossos resultados mostraram que esta miosina também interage com a RPGRIP1L. Ensaios de proximidade de ligação e microscopia confocal indicaram a interação física entre MioVa e RPGRIP1L nos centrossomos durante a mitose e na base do cílio primário durante a intérfase. Surpreendentemente, nós também observamos MioVa ao longo do cílio primário, um fato novo e inesperado, uma vez que esta organela é formada basicamente por microtúbulos. Juntos, nossos resultados revelam a RPGRIP1L como uma nova parceira de interação da MioVa, abrindo perspectivas para a compreensão do papel deste motor molecular no centrossomo e no cílio primário

Abstract: The human myosin Va (MyoVa) is a dimeric motor protein that uses the energy released from the ATP hydrolysis to move along the actin cytoskeleton. Its main function involves the transport of cargoes whitin the cell, such as vesicles, organelles, messenger RNA and regulatory proteins. To do that, the cargoes are attached to the cargo-binding domain (CBD) situated at the myosin C-terminus. Usually, the binding does not occur directly, but it is mediated by partner proteins, sometimes also called adapter proteins, which are attached on the cargoes surface. For this reason, mutations in the genes encoding for MyoVa or its partner proteins are associated with some pathologies, including the Griscelli syndrome type 1, characterized by albinism and neurological disorders. Although MyoVa has been extensively studied, few MyoVa-binding proteins have been described, hampering the understanding of several MyoVa-dependent cellular processes. In order to fill this gap, we searched for new MyoVa binding-partners, screening a human fetal brain cDNA library by the yeast two-hybrid method. After the validation step, we selected the protein RPGRIP1L as our target. RPGRIP1L is a cilia-centrosomal multidomain protein that plays a key role in the formation of the transition zone at the base of the primary cilium, an organelle that senses a wide variety of extracellular signals. Using GST-pull down and microscale themophoresis assays, we showed that MyoVa-CBD binds to the RPGRIP1L-C2 domains with low affinity (KD between 3 and 9 µM), which is typical of transient protein-protein interactions. Moreover, our yeast two-hybrid data using point mutations on the MyoVa-CBD surface indicated that the residues W1713, Y1721, Q1755 and F1792 are involved in RPGRIP1L recognition. Those residues are fully conserved in MyoVb and our results showed that this myosin also interacts with RPGRIP1L. Proximity ligation assays and confocal microscopy evidenced the physical interaction between MyoVa and RPGRIP1L in the centrosomes during mitosis and at the base of the primary cilium during interphase. Surprisingly, we also noticed MyoVa along the primary cilium, a new and unexpected finding, since this organelle is essentially formed by microtubules. Together, our results unveil RPGRIP1L as a novel binding partner of MyoVa, paving the way for future studies aiming to clarify the role of this molecular motor in the centrosome and primary cilium
Subject: Miosinas
Proteína RPGRIP1L humana
Centrossomos
Editor: [s.n.]
Citation: ASSIS, Leandro Henrique de Paula. A descoberta da interação entre miosina Va e RPGRIP1L: caracterização do complexo e localização no centrossomo = The discovery of the interaction between myosin Va and RPGRIP1L: characterization of the complex and localization at the centrosome. 2016. 1 recurso online (202 p.). Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: <http://www.repositorio.unicamp.br/handle/REPOSIP/325733>. Acesso em: 31 ago. 2018.
Date Issue: 2016
Appears in Collections:IB - Tese e Dissertação

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