Please use this identifier to cite or link to this item: http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/325620
Type: DISSERTAÇÃO DIGITAL
Degree Level: Mestrado
Title: Análise dos efeitos do dermatan sulfato e da heparina em células progenitoras endoteliais e endoteliais maduras tratadas com tnf-alfa = Analysis of the effects of dermatan sulfate and heparin in mature endothelial and endothelial progenitor cells treated with tnf-alpha
Title Alternative: Analysis of the effects of dermatan sulfate and heparin in mature endothelial and endothelial progenitor cells treated with tnf-alpha
Author: Freitas Filho, Luiz Henrique de, 1991-
Advisor: Vicente, Cristina Pontes, 1965-
Abstract: Resumo: As células progenitoras endoteliais (CPEs) originam-se da medula óssea adulta a partir de hemangioblastos e são ditas como uma população de células pluripotentes imaturas, com alta capacidade de proliferação, sendo capazes de migrar para locais de lesão arterial e participar do remodelamento vascular. Mecanismos relacionados à proliferação, migração e adesão das CPEs à locais de lesão ou sítios de vasculogênese bem como as vias de sinalização envolvidas na ação efetiva dessas células ainda não estão esclarecidos. Os glicosaminoglicanos (GAGs) são considerados moléculas antitrombóticas e anticoagulantes, que podem interferir também no processo inflamatório de diferentes tecidos. Estudos anteriores realizados em nosso laboratório mostraram que o dermatan sulfato (DS), um glicosaminoglicano encontrado também na membrana de células endoteliais, e que pode ser utilizado com uma droga antitrombótica e anticoagulante, foi capaz de inibir a trombose, aumentar a mobilização e o "homing" das CPEs para o local da injúria em modelo de lesão arterial in vivo e diminuir o processo inflamatório iniciado após a lesão arterial. A heparina (HEP) é outro GAG que tem sido utilizado clinicamente como um potente anticoagulante, antitrombótico e anti-inflamatório. Pesquisas in vitro demonstraram que a HEP inibe a proliferação e migração de células musculares lisas de camundongos. Além disso, foi observado que, células endoteliais tanto humanas quanto bovinas, quando colocadas em meio na presença de heparina, aumentaram sua capacidade de proliferação e migração. O papel destes GAGs no remodelamento do endotélio ainda não está totalmente esclarecido, mas sabe-se que este é um processo complexo que depende da matriz extracelular no leito da ferida, bem como do estímulo para a migração de novas células endoteliais para o local lesionado e que, este processo envolve a ação de inúmeras proteínas/fatores. Este projeto buscou estudar o efeito do DS e da HEP na proliferação, morfologia, adesão, diferenciação e cicatrização envolvendo células endoteliais de cordão umbilical humano (HUVECs), uma linhagem celular estabelecida de células endoteliais adultas e CPEs tratadas ou não com 10ng/mL de TNF-alfa para a indução do processo inflamatório. As CPEs foram obtidas a partir do isolamento de células mononucleares de medula óssea de camundongos e sua diferenciação foi feita em cultura por 30 dias. As células foram ativadas utilizando-se o fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa) e submetidas ao tratamento com DS e a HEP em diferentes concentrações 5mg/mL, 10mg/mL, 25mg/mL e 50mg/mL. Verificamos também as interações entre as HUVECs com plaquetas in vitro e a presença de eNOS e ICAM na presença dos GAGs e do TNF-alfa. Como resultados, pudemos observar que 50mg/mL de DS e 25mg/mL de heparina foram capazes de aumentar a proliferação de HUVECs e CPEs. Já a concentração de 50mg/mL de HEP aumentou a proliferação de HUVECs e CPEs em 48 horas, inibiu a proliferação destas células no tempo de 72 horas. O tratamento das HUVECs e CPEs com TNF-alfa por 24 horas e posteriormente com DS e HEP inibiu a proliferação inicialmente estimulada pelos GAGs. O TNF-alfa aumentou adesão de plaquetas na monocamada de HUVECs in vitro e este efeito pôde ser revertido com DS e HEP. O DS e a HEP foram capazes de inibir a adesão de plaquetas quando colocadas em contato com cultura de HUVECs tratadas com TNF-alfa. A concentração de 50?g/mL de DS foi mais eficaz que 25mg/mL de HEP no processo de cicatrização mesmo após o tratamento com TNF-alfa. O tratamento com 10ng/mL de TNF-alfa foi capaz de aumentar a marcação de ICAM-1 em HUVECs e CPEs, e que esta expressão aumentada voltou ao nível do controle com posterior tratamento com DS e HEP. O DS induziu maior expressão de eNOS em cultura de HUVECs. Podemos então concluir que os GAGs interferem na proliferação e migração das HUVECs e EPCs e que o tratamento com TNF-alfa induz um estado inflamatório que pode ser parcialmente reduzido pelo tratamento com os GAGs e que isso pode estar ocorrendo principalmente pela diminuição da presença de moléculas de adesão como o ICAM-1 e também pela diminuição da adesão plaquetária. Estes resultados auxiliam na explicação dos efeitos observado em outros estudos in vivo dos GAGs na recuperação do endotélio e não só diretamente no processo antitrombótico e anticoagulante

Abstract: Endothelial progenitor cells (EPCs) originate from bone marrow hemangioblasts and are considered a population of immature pluripotent cells with high proliferation capacity, able to migrate to sites of arterial injury and participate in vascular remodeling. The mechanisms related to proliferation, migration and adhesion of EPCs to the lesion sites, as well as the signaling pathways involved in the effective action of these cells are still unclear. Glycosaminoglycans (GAGs) are considered antithrombotic and anticoagulants molecules, that can also interfere in the inflammatory process of different tissues. Previous studies conducted in our laboratory have shown that dermatan sulfate (DS), a GAGs found on the endothelial cell membrane, which can be used as an antithrombotic and anticoagulant drug, has been able to inhibit thrombosis, increase mobilization and homing of EPCs and to decrease the inflammatory process initiated after the arterial lesion. Heparin (HEP) is another GAG that has been used clinically as a potent anticoagulant, antithrombotic and antiinflammatory drug. In vitro research has shown that the HEP inhibits the proliferation and migration of smooth muscle cells in mice. In addition, it was observed that both human and bovine endothelial cells, when placed in medium in the presence of heparin, increased their proliferation and migration capacity. The role of these GAGs in endothelial remodeling is not yet fully understood, but it is known that this is a complex process dependent on the extracellular matrix in the wound bed, as well as the stimulus for the migration of new endothelial cells to the injured site and that, this process, involves the action of numerous proteins / factors. This project aimed to study the effect of DS and HEP on cell proliferation, morphology, adhesion, differentiation and healing involving human umbilical cord endothelial cells (HUVECs), an established cell lineage of adult endothelial cells and EPCs, a progenitor cell treated or not with 10ng/mL of tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha). EPCs were obtained from mice bone marrow mononuclear cells differentiated with an special medium in culture for 30 days. Cells were induced to a pro-inflamatory state using TNF-alpha and treated with DS and HEP at different concentrations 5mg/mL, 10mg/mL, 25mg/mL e 50mg/mL. We also verified the interactions between HUVECs with platelets and in vitro and the expression of eNOS and ICAM-1 in the presence of GAGs and TNF-alpha. As results, we observed that 50mg/mL of DS and 25mg/mL of heparin were able to increase the proliferation of HUVECs and CPEs. The concentration of 50mg/mL of HEP increased the proliferation of HUVECs and CPEs in 48 hours, inhibiting the proliferation of these cells after 72 hours. Treatment of HUVECs and CPEs with TNF-alpha for 24 hours blocked the proliferation increase observed writ DS and HEP. TNF-alpha increased platelet adhesion in the monolayer of HUVECs in vitro and this effect can be reversed through DS and HEP treatments. DS and HEP were able to inhibit platelet adhesion when placed in contact with HUVECs treated with TNF-alpha. The concentration of 50?g/mL DS was more effective than 25mg/mL HEP in the wound healing assay even after treatment with TNF-alpha Treatment with 10ng of TNF-alpha was able to increase the expression of ICAM-1 in HUVECs and CPEs, and this increased expression was normalized with subsequent treatment with DS or HEP. DS also induced higher eNOS expression in culture of HUVECs. We can conclude that GAGs interfere in the proliferation and migration of HUVECs and EPCs and that, the treatment with TNF-alpha, induced an inflammatory state that can be partially reduced by GAGs treatments, mainly by the decreased expression of adhesion molecules like ICAM-1 and decreased platelet adhesion. These results may help to explain the in vivo effect of GAGs in endothelial recovery acting not only as antithrombotic and anticoagulant drugs but as endothelial healing agents
Subject: Glicosaminoglicanos
Endotelio
Remodelação vascular
Inflamação
Editor: [s.n.]
Citation: FREITAS FILHO, Luiz Henrique de. Análise dos efeitos do dermatan sulfato e da heparina em células progenitoras endoteliais e endoteliais maduras tratadas com tnf-alfa = Analysis of the effects of dermatan sulfate and heparin in mature endothelial and endothelial progenitor cells treated with tnf-alpha. 2017. 1 recurso online (86 p.). Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: <http://www.repositorio.unicamp.br/handle/REPOSIP/325620>. Acesso em: 2 set. 2018.
Date Issue: 2017
Appears in Collections:IB - Tese e Dissertação

Files in This Item:
File SizeFormat 
FreitasFilho_LuizHenriqueDe_M.pdf3.25 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.