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Type: TESE DIGITAL
Degree Level: Doutorado
Title: Dinâmica molecular da enzima BCL (Burkholderia cepacia lipase) : aspectos da solvatação e abertura do sítio catalítico na presença de osmólitos e em interfaces
Title Alternative: Molecular dynamics of the enzyme BCL (Burkholderia cepacia lipase) : aspects of the solvation and opening of the catalytic site in the presence of osmolytes and at interfaces
Author: Oliveira, Ivan Pires de, 1987-
Advisor: Martínez, Leandro, 1979-
Abstract: Resumo: No ambiente intracelular algumas pequenas moléculas, comumente chamadas de osmólitos, contribuem para a estabilização de proteínas, quando estas são submetidas a estresse químico e físico. Compreender a natureza das interações destes osmólitos com proteínas pode ajudar no desenvolvimento de novos solventes e até mesmo na sugestão de mutações para aumentar a estabilidade proteica visando aplicações biotecnológicas, por exemplo. Neste trabalho, usaremos como ferramenta de estudo simulações de Dinâmica Molecular (MD) convencionais, para avaliar a dinâmica de solvatação, além de acoplar o método ABF (Adaptive Biasing Force) para estudar a acessibilidade do substrato ao sítio catalítico da enzima BCL (Burkholderia cepacia lipase), tanto na presença de sorbitol aquoso, quanto da proteína disposta em interfaces água/octano e água/éster metílico. Os resultados apresentados em Solvatação competitiva da enzima BCL por sorbitol, uréia e água mostram que o sorbitol promove a organização/orientação das moléculas de água na primeira camada de solvatação e desloca tais moléculas da segunda camada e camadas mais externas, enquanto a uréia apresenta efeito oposto ao observado para o sorbitol. Estes efeitos se mostraram altamente dependentes dos tipos de resíduos da enzima BCL. Os resultados mostram que as interações dos solventes com os resíduos de aminoácidos da superfície proteica são altamente dependentes das características dos átomos que compõem ambos solventes e proteína, e do volume ocupado pelo sorbitol nas camadas de solvatação da BCL, sendo representado por um sistema dinâmico e altamente competitivo. Os resultados descritos em Microsolvatação da enzima BCL por uréia: considerações sobre o estado de protonação dos resíduos ácidos Aspartato e Glutamato mostram que a enzima BCL apresenta maior mobilidade conformacional na presença do desnaturante uréia em pH ácido, conforme esperado. Porém, as interações diretas proteína-uréia não são aumentadas, pois quando os resíduos Asp/Glu estão protonados, perdem parte da capacidade de formarem ligações de hidrogênio bem orientadas com os próprios resíduos da proteína. A aplicação das integrais KB (Kirkwood-Buff Integrals) revelou que a protonação de Asp/Glu afeta o volume de água e uréia na primeira camada de solvatação, deslocando uréia da primeira para as camadas mais externas. Sugerimos que o efeito desnaturante induzido por uréia em pH ácido deve ter suas origens em duas explicações: grande acúmulo de uréia na superfície proteica, mesmo com perda relativa com a protonação de Asp/Glu, e aumento da afinidade do desnaturante pelo backbone protéico. A respeito do caráter estabilizante do sorbitol e relação com a eficiência catalítica da enzima BCL, os resultados apresentados em Aspectos energéticos da abertura do sítio catalítico da enzima BCL na presença de sorbitol mostram que este comportamento pode ser explicado pela conformação preferecialmente aberta do sítio catalítico da proteína, de acordo com as variações de energia livre entre as conformações fechada?aberta obtidas pelo método ABF. Neste caso, o estabilizante diminuiu significativamente as energias livres associadas às estruturas abertas (distanciamento das alfa-hélices 5 e 9). Estruturalmente, o osmólito sorbitol age diretamente no mecanismo de abertura do domínio catalítico, via impedimento estérico das conformações fechadas. Considerando que a enzima BCL é uma lipase com alta atividade catalítica em interfaces orgânico/aquosa, avaliamos este comportamento em Dinâmica orientacional da enzima BCL em interfaces e efeitos na acessibilidade do substrato. Neste caso, acompanhamos a orientação da enzima nas interfaces, que ocorreu em ~75 ns, sendo um processo termodinâmicamente e cinéticamente favorável, possível de ser acompanhado por simulações MD. A orientação também foi acompanhada pela aproximação dos resíduos da tríade catalítica (Ser87-Asp264-His286) com as moléculas de ambas as camadas hidrofóbicas (octano e éster metílico do ácido caprílico), com implicações claras na acessibilidade do substrato. Com a proteína orientada e estabilizada na interface, aplicamos o método ABF e calculamos os perfis de ?G fechada?aberta em solução aquosa e nas interfaces. Os resultados deixam claro que as estruturas abertas são estabilizadas pelas interfaces e que isto pode ser devido aos domínios U1 e U2 serem hidrofóbicos, fato que possibilita a entrada de solvente orgânico no bolsão catalítico, impedindo a aproximação das alfa-hélices 5 e 9 com fechamento de sítio catalítico. Finalmente, espera-se que os resultados apresentados nesta tese auxiliem tanto no entendimento da dinâmica de solvatação de proteínas pelos osmólitos sorbitol e uréia, fornecendo embasamento químico para a compreensão da ação destes compostos em nível biológico, quanto na orientação da enzima BCL em diferentes interfaces, dispondo informações sobre a acessibilidade do substrato ao sítio catalítico, informação útil para uso racional em aplicações biotecnológicas

Abstract: In the intracellular environment, certain small molecules, commonly called osmolytes, contribute to the stabilization of proteins when these are submitted to chemical and physical stress. Understanding the nature of the interactions of these osmolytes with proteins can help in the development of new solvents and even suggest mutations to increase protein stability for biotechnological applications, for example. In this work, we will use a simulation study of conventional Molecular Dynamics (MD) as a tool to evaluate the solvation dynamics, in addition to using the ABF (Adaptive Biasing Force) method to study the accessibility of the substrate to the catalytic site of the BCL (Burkholderia cepacia lipase) enzyme, both in the presence of aqueous sorbitol and of the protein prepared in water/octane and water/methyl ester interfaces. The results presented in competitive solvation of the BCL enzyme by sorbitol, urea and water reveal that sorbitol promotes the organization/orientation of water molecules in the first solvation layer and displaces such molecules of the second and outer layers, while urea has the opposite effect to the one observed for sorbitol. These effects proved to be highly dependent on the types of residue of the BCL enzyme. The results show that the interactions of the solvents with the amino acid residues of the protein surface are highly dependent on the characteristics of the atoms making up both solvent and protein, and of the volume occupied by the sorbitol in the BCL solvation layers, being represented by a dynamic and highly-competitive system. The results described in microsolvation of the BCL enzyme by urea: considerations on the protonation state of the Aspartate and Glutamate acid residues show that the BCL enzyme provides greater conformational mobility in the presence of the denaturant urea at an acid pH, as expected. However, the direct protein-urea interactions are not increased, because when the Asp/Glu residues are protonated, they lose part of the ability to form well-oriented hydrogen bonds with the protein's own residues. The application of the KB (KirkwoodBuff) integrals revealed that the protonation of Asp/Glu affects the volume of water and urea in the first solvation layer, displacing urea from the first to the outer layers. We suggest that the denaturant effect induced by urea at an acid pH must have its origins in two explanations: a large accumulation of urea on the protein surface, even with a relative loss with the protonation of Asp/GLU, and an increased affinity of the denaturant for the protein backbone. With respect to the nature of the stabilizer sorbitol and the relation with the catalytic efficiency of the BCL enzyme, the results presented in energy aspects of opening the catalytic site of the BCL enzyme in the presence of sorbitol show that this behavior can be explained by the preferably open conformation of the protein's catalytic site according to the free energy variations between the closed?opened conformation obtained through the ABF method. In this case, the stabilizer significantly decreased the free energies associated with open structures (distancing of the alpha-helices 5 and 9). Structurally, the osmolyte sorbitol acts directly on the opening mechanism of the catalytic domain through the steric hindrance of closed conformations. Considering that the BCL enzyme is a lipase with high catalytic activity in organic/aqueous interfaces, we assessed this behavior in orientation dynamics of the BCL enzyme in interfaces and the effects on the accessibility of the substrate. In this case, we monitored the orientation of the enzyme at the interfaces, which occurred in ~75 ns, being a thermodynamically and kinetically favorable process that can be monitored through MD simulations. The orientation was also monitored by the approximation of residues of the catalytic triad (Ser87-Asp264-His286) with the molecules of both hydrophobic layers (octane and caprylic acid methyl ester), with clear implications for the accessibility of the substrate. With the protein oriented and stabilized in the interface, we applied the ABF method and calculated the ?G closed?open profiles in an aqueous solution and in the interfaces. The results make it clear that the open structures are stabilized by the interfaces and that this may be due to the fact that the domains U1 and U2 are hydrophobic, which allows for the entry of an organic solvent in the catalytic pocket, preventing the approximation of the alpha-helices 5 and 9 with the closure of the catalytic site. Finally, the results presented in this thesis are expected to assist in the understanding of the solvation dynamics of proteins by the osmolytes sorbitol and urea, providing a chemical foundation to understand the action of these compounds on a biological level regarding the orientation of the BCL enzyme in different interfaces, and providing information on the accessibility of the substrate to the catalytic site. This is useful information for rational use in biotechnological applications
Subject: Simulação de dinâmica molecular
Solvatação
Sorbitol
Uréia
Catálise enzimática
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2017
Appears in Collections:IQ - Tese e Dissertação

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