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Type: DISSERTAÇÃO DIGITAL
Degree Level: Mestrado
Title: Seleção e melhoramento de leveduras capazes de fermentar pentoses através de engenharia evolutiva
Title Alternative: Selection and improvement of yeasts capable of fermenting pentoses through evolutionary engineering
Author: Vieira, Carla Ferreira dos Santos, 1990-
Advisor: Maugeri Filho, Francisco, 1952-
Filho, Francisco Maugeri
Abstract: Resumo: A produção de etanol de segunda geração a partir de pentoses presentes em hidrolisados hemicelulósicos do bagaço de cana de açúcar é de grande interesse econômico pois promove o aproveitamento de resíduos, possibilita a substituição de combustíveis fósseis, e permite o aproveitamento mais completo da matéria prima utilizada para a produção de etanol. A levedura Saccharomyces cerevisiae não é capaz de fermentar a fração hemicelulósica do bagaço de cana. Como uma alternativa as linhagens geneticamente modificadas dessa levedura que apresentam os genes para metabolismo da xilose, foi proposto neste trabalho o melhoramento de leveduras selvagens fermentadoras de pentoses através de engenharia evolutiva. Os experimentos foram conduzidos com a fração hemicelulósica do hidrolisado (que contem compostos que inibem o crescimento dos micro-organismos) e com melaço. Uma série de fermentações em modo batelada foram conduzidas com as leveduras Spathaspora passalidarum, Scheffersomyces stipitis, Candida shehatae e Pachysolen tannophilus, com o objetivo de selecionar a melhor linhagem para os experimentos de engenharia evolutiva. S. passalidarum foi escolhida por ter apresentado maiores rendimentos em etanol (0.38, 0.42 e 0.43 g/g), maiores produtividades volumétricas (0.25, 0.42 e 0.34 g/Lh) e maiores concentrações finais de etanol (15.1, 28.9, 40.8 g/L) a partir de 40, 70 e 100 g/L de xilose, respectivamente. A levedura S. passalidarum foi então cultivada em meio contendo apenas melaço como fonte de carbono, que foi gradualmente substituído pela xilose (totalizando 50 g/L de açúcares). Subsequentemente, a xilose foi gradualmente substituída pelo hidrolisado hemicelulósico. As linhagens foram então colocadas em uma concentração mais alta desses compostos (75 g/L de açúcares totais). A linhagem SP 036, evoluída em meio sólido, consumiu todo o ácido acético presente no meio (1.0 g/L) mais rapidamente que a linhagem parental (34 h vs 60 h) e exibiu rendimento em etanol e produtividade volumétrica em etanol 22 % maiores que a linhagem parental. A linhagem evoluída em meio líquido SP F005 exibiu uma melhor performance fermentativa e um diferente consumo preferencial de açúcares (primeiramente sacarose e depois xilose). Além de ter sido capaz de consumir toda a sacarose, glicose e frutose presentes no meio, o seu rendimento em etanol, rendimento em biomassa e sua produtividade volumétrica foram 59 %, 83 % e 46 % maiores que os da linhagem parental. Finalmente, fermentações em co-cultura foram realizadas com as cepas S. passalidarum parental e SP F005 com o objetivo de aproveitar as características de consumo de açúcares de cada uma delas. Ganhos importantes foram obtidos: (i) a produção de etanol nas fermentações em co-cultura (30.31 g/L), foi maior quando comparada a produção de etanol, a partir do mesmo meio de cultura, por S. passalidarum (15.4 g/L) e SP F005 (22.5 g/L) individualmente; (ii) o aproveitamento dos açúcares nas fermentações em co-cultura foi maior (S. passalidarum parental e SP F005 deixaram, respectivamente, 26.6 e 30 g/L de açúcares residuais totais, a partir de 37.5 g/L de açúcares presentes no melaço e 37.5 g/L de xilose provenientes do hidrolisado hemicelulósico e em co-cultura as cepas deixaram 12.15 g/L de açúcares residuais)

Abstract: The production of second-generation ethanol from pentoses present in hemicellulose hydrolysate from sugarcane bagasse is of great economic interest because it promotes waste recovery, enables the replacement of fossil fuels, and allows fuller use of the raw material used in the ethanol production. The yeast Saccharomyces cerevisiae (Sc), commonly used in the industries for the production of ethanol is not able to ferment the hemicellulose fraction of bagasse. As an alternative to genetically modified Sc yeast that harbour the genes for xylose metabolism, this work investigated the improvement of naturally pentose fermenting wild yeasts, through evolutionary engineering. Experiments were conducted with the hemicellulose fraction of the hydrolysate (containing chemicals that inhibit the growth of microorganisms) as well as molasses. Firstly, a series of batch fermentations were conducted with the strains Spathaspora passalidarum NRRL Y-27907, Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124, Candida shehatae NRRL Y-12856 and Pachysolen tannophilus NRRL Y-2460, in order to select the best yeast candidate for evolutionary engineering experiments. S. passalidarum was chosen because it presented higher ethanol yields (0.38, 0.42 e 0.43 g/g), higher volumetric productivities (0.25, 0.42 e 0.34 g/Lh) and final ethanol concentrations (15.1, 28.9, 40.8 g/L) from 40, 70 e 100 g/L of xylose respectively. Sp yeast was grown in a medium containing molasses as the only carbon source, and then gradually replaced by xylose (50 g/L of total sugars). Subsequently, xylose was gradually replaced by the hemicellulose hydrolysate. Then, the strains were placed in increasing concentrations of these raw materials (75 g/L of total sugars). At the end of this work, it was possible to obtain evolved strains that showed improved tolerance towards hemicellulose hydrolysate and different sugars consumption profile, that were explored in co-culture fermentations. The strain SP 036, that was evolved in a solid medium, consumed all the acetic acid (1 g/L) present in the medium much quicker than the parental strain (34h vs 60h) and exhibited an ethanol yield and volumetric productivity about 22% higher than the parental strain. Strain evolved in a liquid medium exhibited improved fermentation performance and preferential uptake of sugars (sucrose first and then xylose) for the evolved strain SP F005. In addition to being able to consume all of the sucrose, glucose and fructose present in the medium (parental strain does not consume sucrose in the presence of the hydrolysate), the ethanol yield of 0.50 g/g, was 59% higher than the parental strain, biomass yield was 83% higher and the volumetric productivity 46% higher than the parental strain. Finally, the results obtained from S. passalidarum and SP F005 co-cultures fermentations showed important features: (i) the production of ethanol in co-culture fermentations (30.31 g/L) was higher than the production of ethanol obtained by S. passalidarum (15.4 g/L) and SP F005 (22.5 g/L), individually; (ii) the sugars consumption in co-culture fermentations was more complete (S. passalidarum and SP F005 had 26.6 e 30 g/L of sugars remaining versus 12.15 g/L in co-culture., from 37.5 g/L of sugars present in molasses and 37.5 g/L of xylose from the hemicellulose hydrolysate)
Subject: Etanol 2G
Evolução
Hemicelulose
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2016
Appears in Collections:FEA - Tese e Dissertação

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