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Type: TESE DIGITAL
Degree Level: Doutorado
Title: Avaliação da resistência/susceptibilidade a Leishmania amazonensis em macrófagos mutantes para o gene Von Hippel Lindau e estudo da expressão de marcadores de superfície de macrófagos frente à infecção com L. amazonensis
Title Alternative: Evaluation of the resistance/susceptibility to Leishmania amazonensis in macrophages from the Von Hippel Lindau gene mutants and study of cell surface markers in macrophage infected with L. amazonensis
Author: Costa, Solange dos Santos, 1983-
Advisor: Giorgio, Selma, 1962-
Abstract: Resumo: Leishmania spp. são parasitas obrigatórios de células fagocíticas mononucleares, responsáveis pelo aparecimento de um grupo de doenças que variam de lesões cutâneas simples, lesões mucosas e a leishmaniose visceral. As lesões causadas por L. amazonensis, espécie utilizada nestes estudos, apresentam características de tecido hipóxico, uma vez que apresentam parasitas em proliferação, migração de células inflamatórias, infecções secundárias com bactérias anaeróbias e a expressão do fator induzido por hipóxia (HIF-1 alfa). O HIF-1, um heterodímero composto por uma subunidade beta, expressa no núcleo das células, e por uma subunidade alfa regulada pela concentração de oxigênio. Em condições normais de oxigênio a subunidade alfa sofre hidroxilação pelas enzimas prolil-hidroxilases, é reconhecida pela proteína Von Hippel Lindau (pVHL) e marcada para a degradação proteossomal. Em condições de hipóxia ou na ausência da pVHL, ocorre a estabilização da subunidade alfa no citoplasma, que transloca-se para o núcleo onde forma um heterodímero a subunidade beta e pode ativar mais de 100 genes de resposta a hipóxia. O modelo que constitui um fenótipo hipóxico com a expressão constante de HIF-alfa? é encontrado em células de pacientes que apresentam a síndrome de VHL. Neste trabalho avaliou-se o perfil da infecção de macrófagos originados de monócitos de sangue periférico de pacientes com VHL e de camundongos transgênicos para o gene VHL infectados com L amazonensis. Os ensaios in vitro, macrófagos de paciente VHL e/ou de camundongos mutantes para o gene VHL não mostraram diferenças na carga parasitária em relação a macrófagos controle (indivíduo saudável). Nos ensaios in vivo camundongos mutantes para VHL e C57BL/6 foram infectados e após 60 dias observou-se lesões menores e carga parasitária reduzida em camundongos mutantes VHL, os dados in vivo indicam que HIF-1alfa pode estar envolvido no controle da infecção. Outro aspecto da leishmaniose estudado nesse trabalho relaciona-se ao fato de que macrófagos sofrem mudanças após a infecção com Leishmania, tais como, alterações na expressão de proteínas e síntese de citocinas e inibição da produção de metabólitos tóxicos de oxigênio e nitrogênio. A apresentação de antígenos e a ativação dos macrófagos são fatores cruciais para a resposta imune do hospedeiro, a qual pode conduzir a cura espontânea ou evoluir para a forma clínica da leishmaniose. Neste trabalho avaliou-se a expressão dos receptores de superfície CD14, CD11C, CD11B, CD18, CD54, CD206, MHC classe II, TLR-2, CD80 e CD86 de macrófagos humanos originados de monócitos de sangue periférico de indivíduos saudáveis, frente a infecção com L. amazonensis. A fenotipagem celular realizada por citometria de fluxo revelou que houve modulação negativa da expressão de CD14, CD11C, CD11B, CD18, CD54 e MHC II em macrófagos com alta carga parasitária, e nenhuma alteração ocorreu na expressão dos marcadores após internalização dos parasitas e em macrófagos com baixa carga parasitária, o que sugere que a presença de amastigotas intracelulares interfere na expressão de moléculas envolvidas na resposta imune inata e apresentação de antígeno

Abstract: Leishmania spp. parasite of mononuclear phagocytes is involved for the appearance of diseases that range from simple cutaneous lesions, mucosal lesions and visceral leishmaniasis. The lesions caused by L. amazonensis used in these studies have hypoxic tissue characteristics because show proliferating parasites, migration of inflammatory cells migration, secondary infection with anaerobic bacteria and expression of the hypoxia inducible factor (HIF-1?). HIF-1 is a heterodimeric that is composed of ? subunit expressed in cell nucleus and an oxygen-regulated ? subunit. Under normoxic conditions ? subunit is hydroxylated by prolyl-hydroxylase enzymes, it is recognized by the protein Von Hippel Lindau (VHL) and marked for degradation by proteasomes. Under hypoxic conditions or the lack pVHL, ? subunit become stabilized in the cytoplasm and translocate to the nucleus, where it dimerizes with ? subunit and activate more than 100 hypoxia-responsive genes. A hypoxic phenotype model with constant HIF-1? expression is observed in cells from the syndrome VHL patients. This study evaluated L. amazonensis infection in peripheral blood monocytes derived macrophages from of VHL patients and transgenic mouse model of VHL gene infected with L. amazonensis. In vitro assay, VHL patient macrophages and/or transgenic mice of VHL gene showed no differences in parasite load, compared with macrophage controls (healthy individual). In vivo assay, transgenic mice of VHL and C57BL/6 mice were infected and after 60 days small lesions and low parasite load were observed in transgenic mice, the in vivo data demonstrate that HIF-1? could be involved in the control of infection. Another aspect of leishmaniasis studied in this work relates to fact the macrophage undergo changes after infection with Leishmania, such as changes in protein expression and synthesis of cytokines and inhibiting the production of toxic metabolites of oxygen and nitrone. The antigen presentation and activation of macrophages are crucial factors for the host immune response, which can lead to spontaneous healing or progress to clinical form of leishmaniasis. In this work was to evaluate surface expression of CD14, CD11c, CD11b, CD18, CD54, CD206, MHC class II, TLR-2, CD80 and CD86 in L. amazonensis- infected peripheral blood monocytes derived macrophages from of healthy individuals. The cell analyses by flow cytometry revealed negative modulation of CD14, CD11c, CD11b, CD18, CD54 and MHC II expression in macrophages with high parasite load, no change in these cell markers was detected in macrophages after parasite internalization and macrophages with low parasite load, suggesting that the presence of intracellular amastigotes interferes in the expression of molecules involved in the innate immune response and antigen presentation
Subject: Leishmania
Macrofagos
Antígenos de superfície
Doença de von Hippel-Lindau
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2016
Appears in Collections:IB - Tese e Dissertação

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