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Type: TESE DIGITAL
Title: Lisado de plaquetas humanas na expansão de células-tronco mesenquimais de polpa dentária
Title Alternative: Platelet lisated for dental pulp mesenchymal stem cell expansion
Author: Bazzano Gonzalez, Marta Delfina, 1962-
Advisor: Marques, Marcelo Rocha, 1976-
Abstract: Resumo: As células-tronco mesenquimais (CTMs) tem se tornado um atrativo em terapia celular e medicina regenerativa, pela sua capacidade de imunomodulação e diferenciação em vários tecidos. Já foram isoladas de inúmeros tecidos do organismo, incluindo os tecidos dentários, como a polpa, onde encontram-se em pouquíssima quantidade, implicando na sua expansão in vitro para o seu uso em terapia. Suplementos padronizados, como o soro fetal bovino (SFB) trouxe questionamentos relativos à xeno-imunização; possibilidade de transmissão de patógenos, príons e micoplasmas, quando utilizados para a expansão de CTMs destinadas a ensaios clínicos. Além disso, fatores de ordem ética e a grande variabilidade na produção dos lotes, limitam o seu uso na cultura. Pesquisas foram direcionadas para a obtenção de um substituto apropriado na cultura, surgindo o interesse da comunidade científica pelos derivados plaquetários. As plaquetas sanguíneas possuem grânulos que contêm vários fatores de crescimento e citocinas que, quando liberados e adicionados ao meio de cultura, funcionam como um suplemento eficaz, em substituição ao SFB. Este estudo, desenvolveu um protocolo para o processamento de um lisado de plaquetas (LP) humanas provenientes de bolsas de concentrados de plaquetas com data de validade expirada, partindo de protocolos citados na literatura, como alternativa ao SFB no meio de cultura e avaliou o seu efeito em CTMs da polpa dentária de terceiros molares. Seis protocolos foram previamente elaborados e testados, até a obtenção de um lisado eficiente na cultura. Terceiros molares provenientes de 3 pacientes entre 17 e 19 anos tiveram suas polpas coletadas e processadas para o cultivo e expansão das CTMs. Para comparar os efeitos dos dois suplementos (LP e SFB), as células foram expandidas em densidade baixa até a quinta passagem, quando os ensaios foram realizados. Após a caracterização por meio de ensaios de imunofenotipagem e o potencial de diferenciação em tecidos de origem mesodérmica (osteogênica, adipogênica e condrogênica), foram avaliados o perfil citogenético, a morfologia e a cinética da população por Ensaio de Population doubling time (PDT). Um pool de seis lisados processados individualmente, foi utilizado como suplemento no meio de cultura na concentração de 10% para todos os ensaios, utilizando como controle meio suplementado com SFB a 10%. Foi observado que o meio suplementado com o pool de lisado de plaquetas sustentou a expansão até a quinta passagem das CTMs, diminuindo o tempo de dobramento da população por passagem (Population doubling time), quando comparadas ao SFB. A capacidade de diferenciação destas células, não foram afetadas pelo LP, e os marcadores de membrana analisados para cada amostra apresentaram poucas diferenças na sua expressão quando comparadas as amostras do SFB. A técnica de bandeamento GTG, para a cariotipagem, após 20 metáfases analisadas por amostra, não evidenciou nenhuma anormalidade estrutural ou morfológica dos cromossomos. Concluímos que o lisado de plaquetas pode tornar-se um substituto eficiente para o SFB, quando se tem o objetivo de expandir in vitro CTMs da polpa dentári

Abstract: Mesenchymal stem cells (MSC) has become interesting in cell therapy and regenerative medicine, due to its immunomodulatory capacity and differentiation in many tissues. MSC's have been isolated from many human body tissues, including dental region, such as pulp, where just few MSC's can be found, so to be used in theraphy expansion in vitro has to be performed. Standard supplements such as fetal bovine serum (FBS) brought challenges related to the xeno-immunization; possibility of pathogens transmission, prions and mycoplasmas when MSC¿s expansion are applied on clinical trials. Additionally ethical issues and production quality variation limit its use in cells culture. Researchs are running to obtain suitable substitute, so emerging interest of scientific community for platelet derivatives. Blood platelets have granules which contain various growth factors and cytokines that when released and added to the culture medium act as an effective supplement to replace FBS. Protocols are being developed to process a human platelet lysate (hPL) derived concentrates platelets bags of platelets with expired date, based protocols reported in the literature as an alternative to the FBS in the culture medium and to evaluate their effect on the dental pulp stem cells(DPSCs) of third molars. Previously six protocols were prepared and tested to obtain an efficient culture lysate. Third molars from three patients (17 to 19 years old) had their pulps collected and processed for cultivation and expansion of MSCs. To compare the effects of the two supplements (hPL and FBS), cells were expanded in low density to the fifth passage when the assays were performed. After characterization by immunophenotype tests and the potential to differentiate into mesodermal origin (osteogenic, adipogenic and chondrogenic), evaluated the cytogenetic profile, morphology and population¿s kinetics by Population doubling time (PDT). A pool of six individually processed lysates, was used as a supplement in the culture medium at the concentration of 10% for all tests, using as a control medium supplemented with 10% FBS. It was observed that medium supplemented with hPL pool maintained by the expansion of the fifth passage MSC, reducing the PDT passage compared to FBS. The differentiation capacity of these cells were not affected by the hPL and the membrane markers analyzed for each sample showed few differences in expression when compared to the samples FBS. The GTG banding technique for karyotyping after 20 metaphases analyzed per sample did not show any structural or morphological abnormality of chromosomes. We conclude that the hPL can become an effective substitute for FBS, as has been the objective of expanding in vitro DPSCs
Subject: Células-tronco
Polpa dentária
Terapia baseada em transplante de células e tecidos
Células mesenquimais estromais
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2016
Appears in Collections:FOP - Tese e Dissertação

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