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Type: TESE DIGITAL
Title: Efeito do processo inflamatório sobre as células mesenquimais indiferenciadas dos tecidos periodontais = Effect of inflammation on mesenchymal stem cell from periodontal tissues
Title Alternative: Effect of inflammation on mesenchymal stem cell from periodontal tissues
Author: Albiero, Mayra Laino, 1988-
Advisor: Silvério, Karina Gonzales, 1976-
Abstract: Resumo: O presente estudo avaliou o efeito do processo inflamatório sobre as propriedades das células mesenquimais indiferenciadas do ligamento periodontal (PDLSCs) e sobre a expressão dos marcadores mesenquimais nos tecidos periodontais. Inicialmente as PDLSCs purificadas para o marcador CD105 (hPDL-CD105+) foram expostas ao extrato proteico total da espécie bacteriana Porphyromonas gingivalis (PgPE), e avaliadas quanto ao metabolismo celular, atividade inflamatória, capacidade proliferativa e diferenciação osteogênica. Na sequência, foi analisada a alteração dos marcadores de perfil mesenquimal indiferenciado após a indução da doença periodontal in vivo, e confirmada in vitro. Para isso, hPDL-CD105+ foram expostas à diferentes concentrações de PgPE e avaliadas quanto ao metabolismo celular (ensaio de MTT), a fim de determinar a concentração de PgPE não-citotóxica. Apoptose (marcadores Annexin V e 7-AAD) foi avaliada pela técnica da citometria de fluxo. A atividade pró-inflamatória foi investigada por 1) expressão gênica de interleucina 1-beta (IL-1ß), interleucina 6 (IL-6) e (fator de necrose tumoral alfa (TNF-a), 2) a presença da proteína IL-6 por imunofluorescência 3) qPCR array da via de sinalização IL6/STAT3. Para a avaliação da capacidade de diferenciação osteogênica, foi realizado o ensaio de formação de nódulos minerais, com coloração de vermelho de alizarina (AR) e expressão dos genes para Runt-related transcription factor 2 (RUNX2), fosfatase alcalina (ALP) e osteocalcina (OCN) por RT-qPCR. Doença periodontal experimental por ligadura foi induzida em ratos Wistar durante 7 dias, após este período o grupo somente com indução da doença sofreu eutanásia (n=8) e outro grupo recebeu raspagem da superfície radicular após a remoção da ligadura (n=8), e junto dos animais controle (n=8), sofreram a eutanásia aos 14 dias. Dos tecidos periodontais coletados de ratos foram avaliados a expressão dos marcadores relacionados ao fenótipo mesenquimal indiferenciado (STRO-1, CD105, CD166, CD146), por meio de ensaio de imunohistoquímica e expressão gênica por RT-qPCR. Os mesmos marcadores foram avaliados por citometria de fluxo nas hPDL-CD105+ expostas à PgPE. Os resultados mostraram que doses menores que 3 ?g/ml se mostraram não-citotóxicas, e não foram capazes de induzir apoptose celular. hPDL-CD105+ apresentaram aumento na expressão de citocinas pró-inflamatórias expostas à 2ug/ml de PgPE, e confirmados por um aumento na expressão de 28 genes inflamatórios envolvidos com a via IL6/STAT3. Adicionalmente, essas células apresentaram manutenção do potencial osteogênico com deposição significativa de nódulos minerais e expressão dos genes osteogênicos após exposição à PgPE. Nos tecidos periodontais, a doença periodontal inflamatória induziu um aumento na expressão gênica dos marcadores de superfície CD105 e CD166, e este resultado foi confirmado em nível proteico in situ. Nas hPDL-CD105+ estimuladas com PgPE, houve aumento do marcador de indiferenciação celular STRO-1. E este aumento está correlacionado positivamente ao aumento de expressão gênica da IL-6 nas hPDL-CD105+. Esses dados sugerem que houve uma clara modulação dos marcadores de superfície celulares relacionado ao fenótipo mesenquimal indiferenciado in vitro e in vivo, e que a presença da PgPE não impactou na viabilidade celular e a capacidade de diferenciação osteogênica das hPDL-CD105+, preservando suas propriedades biológicas

Abstract: The present study evaluated the effect of the inflammatory process on mesenchymal stem cell properties from the periodontal ligament (PDLSCs) and on the expression of the mesenchymal cell surface markers in the periodontal tissues. Initially PDLSCs purified with CD105 marker (hPDL-CD105+) were exposed to Porphyromonas gingivalis total protein extract (PgPE), and cells metabolism, inflammatory activity, proliferative capacity and osteogenic differentiation were evaluated. Subsequently, it was analyzed the expression of the mesenchymal cell surface markers after the induction of periodontal disease in vivo, and confirmed in vitro. For this, hPDL-CD105+ were exposed to different concentrations of PgPE and evaluated for cellular metabolism (MTT assay) to determine the non-cytotoxic PgPE concentration. Apoptosis (Annexin V and 7-AAD markers) was assessed by flow cytometry technique. Proinflammatory activity was investigated by 1) gene expression of interleukin 1-beta (IL-1?), interleukin 6 (IL-6) and tumor necrosis factor alpha (TNF-?) by RT-qPCR, 2) presence of IL-6 with immunofluorescence assay 3) qPCR array of IL6/STAT3 signaling pathway. To evaluate osteogenic differentiation capacity, mineral nodules formation was assessed with alizarin red staining (AR) and gene expression for Runt-related transcription factor 2 (RUNX2), alkaline phosphatase (ALP) and osteocalcin (OCN) by RT-qPCR. Experimental periodontal disease by ligature was induced in Wistar rats for 7 days, after this period one group with disease induction only was euthanized (n=8) and one group was received scaling and root planning after removal of the ligature (n=8), and together with the control group (n=8), were euthanized at day 14. From the periodontal tissues collected from rats, the expression of mesenchymal cell surface markers (STRO-1, CD105, CD166, CD146) was evaluated by immunohistochemistry and RT-qPCR gene expression. The same cell surface markers were evaluated by flow cytometry in hPDL-CD105+ exposed to PgPE. Results showed that doses lower than 3 ?g/ml were non-cytotoxic, and were not able to induce apoptosis. hPDL-CD105+ showed increased expression of proinflammatory cytokines exposed to 2ug/ml PgPE, and this was confirmed by an increased expression of 28 inflammatory genes related to the IL6/STAT3 pathway. In addition, osteogenic potential was maintained in the presence of PgPE, with significant deposition of mineral nodules and expression of the osteogenic genes. In rat periodontal tissues, inflammatory disease induced an increase in CD105 and CD166 surface markers gene expression and this result was confirmed in situ at protein level. hPDL-CD105+ stimulated with PgPE showed an increase in STRO-1 stem cell marker. And this increase is positively correlated to increased IL-6 gene expression in hPDL-CD105+. These data suggest that there was a clear modulation of the cell surface markers related to the mesenchymal stem cell phenotype in vitro and in vivo, and that the presence of PgPE did not affect cell viability and osteogenic differentiation capacity of hPDL-CD105+, preserving its biological properties
Subject: Terapia baseada em transplante de células e tecidos
Interações hospedeiro-Patógeno
Doença crônica
Antígenos de superfície
Perfilação da expressão gênica
Language: Multilíngua
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2017
Appears in Collections:FOP - Dissertação e Tese

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