Please use this identifier to cite or link to this item: http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/322170
Type: TESE DIGITAL
Title: Dispositivos microfluídicos para manipulação de células e detecção de componentes celulares
Title Alternative: Microfluidic devices for cell manipulation and detection of cell components
Author: Campos, Richard Piffer Soares de, 1984-
Advisor: Silva, José Alberto Fracassi da, 1970-
Abstract: Resumo: O desenvolvimento de dispositivos microfluídicos é atualmente um dos fatores responsáveis pelo crescente desenvolvimento de técnicas bioanalíticas. Com aplicações desde a manipulação de líquidos em micro escala ao tratamento e análise de amostras, é difícil encontrar um protocolo analítico que não possa ser implementado em escala micro. Adicionalmente, várias etapas analíticas podem ser integradas em um único substrato com vantagens como tempo reduzido de análise, baixo custo energético, baixo consumo de reagentes e amostra, baixa geração de resíduos, entre outras. Tais caraterísticas podem ser especialmente interessantes para inúmeras aplicações em bioanalítica, como na análise de lisados de células e estudos de heterogeneidade celular por análise de células individuais. Nesse contexto, as propriedades do substrato no qual o microchip é construído são de extrema importância pois estas irão determinar a afinidade do analito ao microdispositivo e, consequentemente, a possibilidade ou não de aplicação em determinada análise. Métodos clássicos de microcabricação de dispositivos de vidro são robustos e bem estabelecidos mas demandam condições atmosféficas específicas e tem alto custo. Devido a isso, os substratos poliméricos, em especial o poli(dimetilsiloxano), são mais comumente utilizados em pesquisa acadêmica. Entretanto, a característica altamente hidrofóbica do poli(dimetilsiloxano) pode limitar suas aplicações e materiais alternativos podem ser utilizados para suprir as dificuldades atribuídas ao uso desse elastômero. Desse modo, o presente projeto foi desenvolvido em duas frentes. Na primeira, avaliaram-se as propriedades de diferentes substratos para fabricação de microdispositivos em relação à possibilidade de utilização em análise de compostos apolares, pois esses representam uma dificuldade intrínseca ao poli(dimetilsiloxano). A modificação de poli(dimetilsiloxano) com diviniléter de polietileno glicol foi avaliada em relação à absorção de compostos orgânicos. Adicionalmente, o substrato polimérico não estequiométrico com ligações tiol-eno teve suas propriedades caracterizadas e avaliadas em comparação ao desempenho do poli(dimetilsiloxano) nativo. Um método alternativo para a fabricação de microdispositivos de vidro também foi proposto e sua aplicabilidade avaliada em comparação ao método clássico. Para a segunda parte do projeto, a aplicação de microdispositivos na análise celular foi implementada. Foi desenvolvimento um michochip para separação eletroforética e detecção indireta de espécies reativas de oxigênio em sistema acoplado a um detector de fluorescência induzida a laser. Desta forma, focou-se na detecção e avaliação das concentrações de superóxido gerado em amostras de macrófagos RAW 264.7 mediante estímulo externo, com a obtenção de um acréscimo de concentração de cerca de 15 vezes em relação a células não estimuladas. O preparo das amostras celulares foi otimizado para o sistema empregado e os efeitos da incubação dos macrófagos na presença de 3-morfolino-sidnonimina como um doador de íons superóxidos foram demonstrados. Finalmente, experimentos em sistema de análise de células individuais também foram realizados com macrófagos e linfócitos adaptando-se o microdispositivo. Os resultados para detecção de superóxido nesse sistema demonstraram evidências da diferença de resposta de macrófagos de uma mesma população ao protocolo de estímulo empregado, evidenciando a capacidade de caracterizar a heterogeneidade celular em métodos de análise de células individuais utilizando dispositivos microfluídicos

Abstract: The development of microfluidic devices is currently one of the factors responsible for the increased development of bioanalytical techniques. With applications ranging from liquid manipulation to sample analysis, it is difficult to find a protocol that cannot be implemented in micro scale. Additionally, several analytical steps can be integrated on a single substrate, leading to advantages such as fast analysis, low energetic cost, low reagent and sample consumption, low residue generation, among others. Such characteristics are especially interesting for numerous bioanalytical applications, such as the analysis of cell lysates and cellular heterogeneity studies using single cell analysis. In this context, the properties of the microchip¿s substrate are extremely important because they will determine the affinity between the analyte and the microdevice and, consequently, the possibility of use such device in a given application. Classic microfabrication methods for glass microdevices are robust and well established but demand specific ambient conditions and are costly. Due to that, polymeric substrates, especially poly(dimethylsiloxane), are more commonly used in academia. However, poly(dimethylsiloxane)¿s highly hydrophobic characteristic can limit its applications. Thus, alternative materials and methods can be used to overcome these difficulties. Therefore, the present work was developed in two parts. In the first, the properties of different substrates for the fabrication of microdevices were studied. The modification of poly(dimethylsiloxane) with divynilether polyethylene glycol was evaluated regarding its absorption and adsorption of organic compounds. Additionally, a off-stoichiometric thiol-ene polymer was characterized in comparison to a native poly(dimethylsiloxane) substrate. An alternative method for glass microdevice fabrication was also proposed and its applicability was evaluated. In the second part of the project, a microdevice for cellular analysis was developed. The microchip was implemented for electrophoretic separation and detection of reactive oxygen species, using a system coupled to a laser induced fluorescence detector. Here, we focused on the indirect detection and evaluation of superoxide generated in RAW 264.7 macrophages after an external extimuli. The results showed an increase of 15 fold in comparison to non-treated cells. The cellular sample preparation was optimized and the effects of cellular incubation with 3-morpholino-sydnonimine were also demonstrated. Finally, the microdevice was used for single cell analysis of macrophages and lymphocytes by adapting the microchip operation method. The results for superoxide detection at single cell levels showed evidences of the different macrophage individual response in comparison to the entire cell population and highlighted the ability to study cell heterogeneity in these systems
Subject: Microfluidica
Espécies reativas de oxigênio (ERO)
Poli(dimetilsiloxano)
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2016
Appears in Collections:IQ - Tese e Dissertação

Files in This Item:
File SizeFormat 
Campos_RichardPifferSoaresde_D.pdf4.8 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.