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Type: TESE DIGITAL
Title: Perfil de RNAs ligados a proteína Caprin-1
Title Alternative: Profile of Caprin-1 RNA-targets
Author: Migita, Natacha Azussa, 1988-
Advisor: Massirer, Katlin Brauer, 1975-
Abstract: Resumo: Proteínas de ligação a RNA (RNA-binding proteins - RBPs) regulam pós-transcricionalmente um vasto número de genes. Sabe-se que mutações em RBPs ou alterações na sua regulação estão associadas a doenças neurodegenerativas. Essas RBPs induzem a formação de inclusões patológicas, que frequentemente estão co-localizadas com marcadores de grânulos de estresse (SGs). A proteína Caprin-1 (ou RNG-105) é uma RBP citoplasmática expressa em tecidos de mamíferos e é particularmente abundante nos neurônios. Liga-se a mRNAs-alvos em complexos ribonucleoproteicos mensageiros (mRNPs) regulando o seu processamento. Observou-se que a expressão ectópica (EE) de Caprin-1 induz a formação de SGs. Deste modo, o presente estudo buscou avaliar o mecanismo molecular pelo qual Caprin-1 atua na indução de SGs e compreender a sua função, com enfooque no grupo de RNAs-alvos regulados. Para isso, utilizamos células humanas superexpressando Caprin-1 seguida de análises em larga escala, incluindo: RIP-seq (RNA-immunoprecipitation and sequencing) e RNA-seq (RNA sequencing). Os resultados de RIP-seq mostrou um enriquecimento de 63% de rRNAs e 23% de genes codificadores de proteínas no RIP de Caprin-1 em relação ao controle. Pela classificação funcional do subgrupo de RNAs que codificam proteínas, observamos que muitos constituintes ribossomais e componentes da maquinaria de iniciação da tradução foram enriquecidos. Nós confirmamos a co-imunoprecipitação do 18S rRNA e NPM1, transcritos relacionados com o complexo de iniciação da tradução e biogênese de ribossomos. Digno de nota, em nosso trabalho observamos que Caprin-1 pode estar auto-regulando sua expressão, mas os mecanismos envolvidos ainda não estão claros. Através da co-imunoprecipitação proteica, validamos as interações de Caprin-1 com a RPS3 (proteína da subunidade ribossomal 40S) e com a RBP hnRNPC1 /C2 que atua no processamento de pre-mRNAs, transporte e na estabilização de mRNAs. Pelas análises de transcriptômica, observamos que a EE de Caprin-1 atua de forma global na expressão diferencial de genes. Porém, na classificação funcional dos genes diferencialmente expressos, observamos uma repressão de classes funcionais importantes, tais como constituintes ribossomais, da maquinaria de tradução e do metabolismo celular. Em conjunto, nossos resultados mostram uma correlação entre o papel de Caprin-1 em Grânulos de estresse e no processamento de RNAs. Nesta perspectiva, acreditamos que as interações de Caprin-1 com os RNAs-alvos podem modular os grânulos e a regulação da tradução. Desta forma, o nosso resultado contribuiu na investigação do papel de Caprin-1 em Grânulos de estresse, uma vez que a importância fisiológica da maioria dos alvos de mRNAs identificados ainda não foram esclarecidas

Abstract: Caprin-1 (also known as RNG-105) is a cytoplasmic RNA-binding protein (RBP) expressed in mammalian tissues and is particularly abundant in neurons as part of RNA granules. This RBP binds mRNA targets in mRNPs and contains a conserved RG-rich domain, which is related to cellular granules and to reversible aggregation of proteins. Ectopic expression (EE) of Caprin-1 induces assembly of high-density cytoplasmic granules, called stress granules. Because activity and aggregation of RBPs are associated with many neurodegenerative and protein-misfolding diseases, we wanted to know the molecular mechanism by which Caprin-1 mediates stress granule induction and understand its function, focusing on the group of its RNA-targets. Here, we use human HEK293T cells to perform large-scale analysis including: RNA-immunoprecipitation and sequencing (RIP-seq) and RNA-sequencing (RNA-seq) upon Caprin-1 EE. RIP-seq results show 63% of rRNAs and 23% of protein-coding genes enriched in Caprin-1 RIP-seq in relation to control. Among the subgroup of RNA coding genes, most of the target candidates represent constituent of ribosome and components of translational initiation machinery. We have confirmed a handful of Caprin-1 transcripts-target involved in ribosome and translation initiation complex as 18S rRNA and NPM1. Interestingly, here we show that Caprin-1 protein auto-regulates its expression, but the molecular mechanisms have still to be elucidated. Through co-IP, we validated interactions of Caprin-1 with RPS3 and hnRNPC1/C2, ribosomal 40S subunit protein and a RBP that act to stabilize transcripts, respectively. By EE experiments, Caprin-1 is neither a universal repressor nor a universal activator, but some classes involved in translation machinery have been overepresented as repressed in the GO analysis. The combination of our results add to a link between Caprin-1 in stress granules and RNA processing. In this view, we propose that Caprin-1-RNA interactions might modulate stress granule and translation regulation and we expect to contribute to the understanding of its broader involved in neurodegenerative diseases. The next step is investigating the cellular and mechanistic understanding of the Caprin-1-dependent stress granules, since the physiological significance of most of the identified RNA targets has not yet been investigated
Subject: Proteínas de ligação a RNA
Grânulos citoplasmáticos
Proteína CAPRIN1 humana
Interação proteína-RNA
Sequenciamento de nucleotídeos em larga escala
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2016
Appears in Collections:IB - Dissertação e Tese

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