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Type: TESE DIGITAL
Degree Level: Doutorado
Title: Produção, caracterização bioquímica e aplicação de L-asparaginase fúngica
Title Alternative: Production, biochemical characterization and application of fungal L-asparaginase
Author: Dias, Fernanda Furlan Gonçalves, 1986-
Advisor: Sato, Helia Harumi, 1952-
Abstract: Resumo: L-Asparaginases são enzimas que catalisam a hidrólise da L-asparagina a ácido L-aspártico e amônia. As L-asparaginases microbianas têm recebido atenção devido ao seu papel no tratamento da leucemia linfoblástica aguda e devido à sua crescente aplicação na indústria de alimentos visando à redução da formação de acrilamida durante o processamento de alimentos. Um número crescente de pesquisas tem estudado a aplicação dessa enzima em diferentes matrizes alimentares comprovando seus efeitos na redução de acrilamida. Neste trabalho, foi estudada a produção de L-asparaginase por oito linhagens de fungos Aspergillus. Entre as 8 linhagens testadas, A. niger LBA 02, A. oryzae CCT 3940, A. oryzae LBA 01 apresentaram maior produção de L-asparaginase, 26,0 U mL-1; 20,6 U mL-1 e 19,1 U mL-1, respectivamente. A linhagem de A. oryzae CCT 3940 foi escolhida para os estudos de produção de L-asparaginase considerando-se as características bioquímicas da enzima (estabilidade em pH 6-8 e 40-50ºC e não inibição na presença de NaCl) para a aplicação potencial em alimentos. Uma estratégia de otimização sequencial foi utilizada para determinar o efeito de diferentes fontes de carbono, fontes de nitrogênio, concentração de indutor (L-asparagina), concentração de inóculo, pH inicial do meio, temperatura e agitção na produção de L-asparaginase de A. oryzae CCT 3940 em fermentação submersa. Na fermentação pelo micro-organismo a 30 °C em meio Czapek modificado composto de prolina (2%), glicose (0,5%), presença do indutor L-asparagina (0,2%), extrato de levedura (0,5%), KH2PO4 (0,152%), KCl (0,052%), MgSO4.7H2O (0,052%), CuNO3.3H2O (0,0001%), ZnSO4.7H2O (0,0001%) e FeSO4.7H2O (0,0001%) ajustado a pH 8,0, concentração de 3 ×107 esporos mL-1, 72 horas de fermentação a 150 rpm, a atividade de L-asparaginase foi de 67,49 U mL-1, o que representa um aumento de 225% em relação às condições iniciais não-otimizadas. A L-asparaginase de A. oryzae CCT 3940 foi purificada em um processo de quatro etapas e a massa molecular foi estimada em 115 kDa. A enzima purificada apresentou atividade ótima na faixa de pH de 7,0-8,0 a 40-50 °C. A enzima purificada apresentou atividade anti-proliferativa contra várias linhagens de células tumorais humanas, sem, contudo, inibir completamente o crescimento da linhagem não tumoral. Para verificar a eficácia da enzima e da preparação comercial de L-asparaginase em reduzir acrilamida em alimentos, batata em cubos (2 cm de aresta) foram submetidas a imersão por 30 minutos a 50 °C em três tratamentos: (i) em água destilada; (ii) água destilada com L-asparaginase purificada e (iii) água destilada com enzima comercial. A L-asparaginase purificada promoveu uma redução de 72% na formação de acrilamida enquanto que a enzima comercial apresentou 92% de redução em comparação com o sistema controle. Os resultados obtidos nessa pesquisa, indicam que a enzima L-asparaginase de A. oryzae CCT 3940 possui características bioquímicas e atividade biológica atrativas para a indústria de alimentos e para a indústria farmacêutica

Abstract: L-asparaginases are enzymes that catalyze the hydrolysis of L-asparagine to L-aspartic acid and ammonia. Microbial L-asparaginases have received attention due to its role in the treatment of acute lymphoblastic leukemia and due to its increasing use in the food industry aimed at reducing acrylamide formation during food processing. An increasing number of studies has made the application of this enzyme in different food matrices and proven its effects on the reduction of acrylamide. In this study, the production of L-asparaginase by eight strains of Aspergillus fungi was assessed. Among the eight tested strains, A. niger LBA 02, A. oryzae CCT 3940 and A. oryzae LBA 01 showed higher production of L-asparaginase, 26,0 U mL-1; 20,6 U mL-1 e 19,1 U mL-1, respectively. The strain of A. oryzae CCT 3940 was selected for the production of L-asparaginase studies considering the biochemical characteristics of the enzyme (stability at pH 6-8 and 40-50 ° C, and no inhibition in the presence of NaCl) for potential application in food. A sequential optimization strategy was used to determine the effect of different carbon sources, nitrogen sources, inductor concentration (L-asparagine), inoculum concentration, initial pH of the medium, temperature and agitation in the production of L-asparaginase from A. oryzae CCT 3940 in submerged fermentation. In the fermentation of the microorganism at 30 °C, in modified Czapeck medium consisting of proline (2%), glucose (0.5%), L-asparagine (0.2%), yeast extract (0.5%), KH2PO4 (0.152%), KCl (0.052%), MgSO4.7H2O (0.052%), CuNO3.3H2O (0.0001%), ZnSO4.7H2O (0.0001%) and FeSO4.7H2O (0,0001%) pH adjusted to pH 8.0, inoculum concentration of 3 × 107 spores mL-1, 72 hours of fermentation at 150 rpm, L-asparaginase activity was 67.49 U mL-1. This represents an increase of 225% compared to non-optimized initial conditions. The L-asparaginase from A. oryzae CCT 3940 was purified in a four-step process, and the molecular mass was estimated as 115 kDa. The purified L-asparaginase from A. oryzae CCT 3940 exhibited optimal activity at pH 7.0-8.0 at 40-50 °C. The purified enzyme showed anti-proliferative activity against various human tumor cell lines without, however, completely inhibit the growth of non-tumor cell line. In order to verify the effectiveness of the enzyme and of the commercial preparation of L-asparaginase on reducing acrylamide in foods, potato cubes (2 cm edge) were subjected to soaking for 30 minutes at 50 °C in three treatments: (i) distilled water; (ii) distilled water with purified L-asparaginase and (iii) distilled water with commercial enzyme. The purified L-asparaginase promoted a 72% reduction in acrylamide formation whereas the commercial enzyme showed 92% reduction when compared to the control system. The results obtained in this study indicate that L-asparaginase enzyme from A. oryzae CCT 3940 has attractive characteristics and interesting biological activity for the food industry and the pharmaceutical industries
Subject: Acrilamida
Aspergillus oryzae
Aspergillus niger
L-asparaginase
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2016
Appears in Collections:FEA - Tese e Dissertação

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