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Type: DISSERTAÇÃO DIGITAL
Degree Level: Mestrado
Title: Identificação e caracterização de genes envolvidos na resposta ao estresse osmótico causado por NaCl em Acidithiobacillus ferrooxidans
Title Alternative: Identification and characterization of genes involved in the response to osmotic stress caused by NaCl in Acidithiobacillus ferrooxidans
Author: Palermo, Bruna Rafaella Zanardi, 1985-
Advisor: Ottoboni, Laura Maria Mariscal, 1955-
Abstract: Resumo: Micro-organismos acidófilos utilizados no processo de biolixiviação, como Acidithiobacillus ferrooxidans, possuem o crescimento inibido quando expostos ao íon cloreto. Em alguns locais onde são executados os processos de biolixiviação, a disponibilidade de água com baixas concentrações de sal é limitada, gerando um alto custo na implementação do projeto de extração mineral, podendo torná-lo inviável. Desta forma, esse trabalho teve como objetivo (i) a identificação e caracterização de genes envolvidos na tolerância ao NaCl em bactérias, por meio de análises de bioinformática em genomas anotados; (ii) a análise de expressão destes genes, por PCR em tempo real, em A. ferrooxidansLR, cultivada na presença de NaCl e (iii) modelagem da estrutura terciária das proteínas codificadas pelos genes que apresentarem maior expressão na presença de NaCl. A linhagem LR de A. ferrooxidans foi escolhida como organismo modelo para experimentos de análise da expressão de genespor se tratar de uma linhagem brasileira apropriada para biolixiviação. Utilizando o genoma da linhagem de A. ferrooxidans ATCC 23270 como referência, os genes de interesse foram selecionados utilizandoModelos Ocultos de Markov (HMM). Os modelos HMM foram construídos a partir de sequências de proteínas homólogas que foram selecionadas do banco de dados do SwissProt. Além da construção dos modelos, alguns HMM foram retirados do banco de família de proteínas Pfam (http://pfam.xfam.org/). Foram utilizados, no total, 74 modelos HMM e, a partir dos resultados obtidos, 10 genes foram selecionados para a análise de expressão na presença de 100 mM de NaCl. Também foram selecionados cinco genes que codificam fatores de regulação da transcrição sigma (?). A análise da expressão dos genes dos fatores sigmas, por PCR em tempo real, mostrou que o fator ?32 foi o mais expresso durante o crescimento da bactéria na presença de NaCl, seguido pelos fatores ?24, ?54 e ?38, enquanto o fator ?70 se mostrou inalterado. A análise da expressão dos genes selecionados a partir dos modelos HMM mostrou que os genes AFE_0461 (proteína hipotética), AFE_1782 (aminoácido permease), AFE_1856 (colina desidrogenase), AFE_3241 (OsmC), AFE_2991(permease transportadora de peptídeo), AFE_2205 (NhaA- antiportador Na+/H+), AFE_2232 (KdpAtransportador de K+) e AFE_0154 (proteína intrínseca de canal de membrana ¿ MIP) apresentaram expressão significativamente maior na presença de NaCl. O modelo da estrutura molecular da proteína codificada pelo gene AFE_0461foi gerado e denominado neste trabalho de YceI_Afe, pois esta proteína possui um domínio da família de proteínas YceI, contendo 23 resíduosde aminoácidos(His48, Val51, Phe53, Ile55, His57, Phe67, Thr75, Phe76, Asp84, Arg85, Val86, Ile88, Ile90, Leu106, Ile120, Phe122, Phe152, Phe176, Ile182, Arg184, Ile193, Val207 e Val210). A predição da estrutura da proteína mostrou que ela apresenta estrutura em barril beta e que, provavelmente, se liga ao 2-octaprenil 6-hidroxifenol (8PP), um dos precursores da síntese de ubiquinona. Recentemente, uma das funções da ubiquinona foi associada à estabilidade da membrana celular em E. coli sob condição de estresse salino causado por NaCl. Dessa forma, é possível que a proteína YceI possa estar envolvida na resposta ao estresse salino em A. ferrooxidans através da biossíntese da ubiquinona

Abstract: Acidophilic microorganisms, such as Acidithiobacillus ferrooxidans, used in the bioleaching process have their growth inhibited by chloride ions. In some bioleaching operations the availability of water with low salt concentration is limited which can elevate the price of the mining operation making it infeasible. Thus, this study aimed to (i) identify and characterize genes involved in NaCl tolerance in bacteria through bioinformatics analysis of annotated genomes; (ii) analyze gene expression by real-time PCR in A. ferrooxidansLR grown in the presence of NaCl and (iii) tertiary structure prediction of proteins encoded by genes up-regulated in the presence of NaCl. A. ferrooxidansstrain LR was chosen as model organism for gene expression analysis since it is a Brazilian strain appropriate for bioleaching. Using the genome of A. ferrooxidans ATCC 23270 as a reference, the genes of interest were selected using Hidden Markov Models (HMM). The HMM models were made from homologous protein sequences selected from the SwissProt database. In the construction of models, some HMM were obtained from the protein family database Pfam (http://pfam.xfam.org/). A total of 74 HMM models were used and based on the results, 10 genes were selected for expression analysis in response to 100 mM NaCl. In addition, five genes encoding the transcription factors sigma (?) were selected. Gene expression analysis of the sigma factor genes, by real-time PCR, showed that?32 was the most expressed during growth in the presence of NaCl, followed by?24, ?54 and ?38, while the expression of the ?70 gene remained unchanged. Expression analysis of the genes selected from the HMM models showed that AFE_0461, AFE_1782, AFE_1856, AFE_3241, AFE_2991, AFE_2205, AFE_2232 and AFE_0154 were up-regulated in the presence of NaCl. The model of the molecular structure of the protein encoded by AFE_0461 gene was generated and named YceI_Afe in this work, because this protein has a domain family of proteins YceI containing 23 amino acid residues (His48, Val51, Phe53, Ile55, His57, Phe67, Thr75, Phe76, Asp84, Arg85, Val86, Ile88, Ile90, Leu106, Ile120, Phe122, Phe152, Phe176, Ile182, Arg184, Ile193, Val207 e Val210). The prediction of protein structure showed that it has ?-barrel structure and probably binds to octaprenil 2-6-hydroxyphenol (8PP), one of the precursors of ubiquinone synthesis. Recently, ubiquinone has been associated with cell membrane stability in E. coli cells submitted to salt stress by NaCl. Thus, it is possible that the YceI protein may be involved in the salt stress response in A. ferrooxidans through ubiquinone biosynthesis
Subject: Modelos markovianos ocultos
Reação em cadeia da polimerase em tempo real
Modelagem molecular
Editor: [s.n.]
Citation: PALERMO, Bruna Rafaella Zanardi. Identificação e caracterização de genes envolvidos na resposta ao estresse osmótico causado por NaCl em Acidithiobacillus ferrooxidans. 2016. 1 recurso online ( 107 p.). Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: <http://www.repositorio.unicamp.br/handle/REPOSIP/321902>. Acesso em: 30 ago. 2018.
Date Issue: 2016
Appears in Collections:IB - Tese e Dissertação

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