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Type: TESE DIGITAL
Title: Estudos estruturais e funcionais de uma fosfolipase A2 homóloga K49 purificada do veneno de Crotalus oreganus abyssus
Title Alternative: Functional and structural studies of a K49 phospholipase A2 homologue purified from the venom of Crotalus oreganus abyssus
Author: Almeida, José Rafael de, 1989-
Advisor: Marangoni, Sérgio, 1951-
Abstract: Resumo: Venenos de serpentes constituem uma rica fonte de moléculas biologicamente ativas capazes de atuar em alvos celulares específicos e modular uma distinta variedade de funções fisiológicas. Fosfolipases A2 homólogas Lys49 são abundantes proteínas presentes nessas complexas secreções, que embora cataliticamente inativas, desempenham uma ampla gama de atividades, tais como: miotoxicidade, citotoxicidade, atividade antibacteriana, antifúngica, entre outras. O veneno de Crotalus oreganus abyssus não tem sido muito estudado, portanto, a caracterização de seus componentes representa uma ferramenta biotecnológica valiosa para o estudo dos eventos fisiopatológicos do envenenamento e para uma melhor compreensão de seus efeitos biológicos. No presente trabalho, uma fosfolipase A2 homóloga Lys49, denominada CoaTx-II, do veneno de Crotalus oreganus abyssus foi purificada e caracterizada estrutural e farmacologicamente. CoaTx-II foi isolada com elevado grau de pureza através da combinação de duas etapas cromatográficas: exclusão molecular e cromatografia líquida de alta eficiência fase reversa. A toxina PLA2 Lys49 caracteriza-se como um dímero e apresenta uma massa de 13868,2 Da, determinada por espectrometria de massas. A caracterização da estrutura primária de CoaTx-II permitiu identificar e caracterizar a mesma como uma PLA2 homóloga Lys49 básica. A toxina apresenta alta identidade com outras PLA2s homólogas Lys49 que apresenta elevados pontos isoelétricos e é constituída por um elevado número de resíduos de aminoácidos carregados positivamente. O modelo estrutural de CoaTx-II determinado por modelagem molecular apresentou todas estruturas secundárias típicas de uma PLA2 e um arcabouço tridimensional conservado. Apesar da inatividade enzimática, in vivo CoaTx-II desencadeou extensivo dano muscular local, caracterizado por aumento nos níveis da atividade creatina quinase plasmática e confirmado por alterações morfológicas avaliadas em análises histológicas, além de atividade inflamatória evidenciada por ensaio de edema de pata e aumento nos níveis de citocina pró-infalmatória IL-6. Essas atividades biológicas resultam de mecanismos independentes da atividade enzimática. Uma biblioteca de peptídeos desenhados com base na estrutura primária de CoaTx-II e região C-terminal de outras PLA2s foi obtida através de síntese peptídica em fase sólida. A metodologia de síntese adotada nesse trabalho possibilitou a obtenção dos peptídeos com elevado grau de pureza e bons rendimentos. A avaliação biológica dessa biblioteca revelou que o peptídeo C-terminal (115-129) de CoaTx-II, bem como seus derivados modificados (peptídeos com substituição de resíduos de aminoácidos) e peptídeos C-terminal (115-129) de outras PLA2s, apresentaram atividade antibacteriana contra bactérias Gram-negativas: Escherichia coli (E. coli ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa ATCC 27853; P. aeruginosa 31NM) e Gram-positivas: Staphylococcus aureus (S. aureus BEC9393; S. aureus rib1). Os resíduos de aminoácidos positivos presentes na estrutura primária desses peptídeos desempenham um papel importante na mediação desse efeito e fornecem pistas sobre o mecanismo de ação dos mesmos, o qual provavelmente inicia-se por interações eletrostáticas. Assim sendo, nossos resultados evidenciaram que CoaTx-II exerce uma atividade central como mediadora (miotóxica local e inflamatória) de eventos degenerativos associados ao envenenamento por Crotalus oreganus abyssus, bem como demonstraram a propriedade antibacteriana de peptídeos catiônicos sintéticos derivados da estrutura primária de toxinas PLA2s, os quais podem ser usados no design e desenvolvimento de estratégias terapêuticas contra bactérias multi-resistentes

Abstract: Snake venoms are rich sources of biologically active molecules able to act on specific target cells and modulate a diversity of physiological functions. Lys49 phospholipase A2 homologues are abundant proteins present in these complexe secretions, that although catalytically inactive, play a variety of activities, such as: myotoxicity, cytotoxicity, antibacterial, antifungal, among others. The venom from Crotalus oreganus abyssus has not been studied, however, the characterization of its components represents a valuable biotechnological tool for studies of physiopathology of envenomation and a better understanding about its biological effects. In this present study, a Lys49 phospholipase A2 homologue, denominated CoaTx-II, from Crotalus oreganus abyssus snake venom was purified and structural and pharmacologically characterized. CoaTx-II was isolated with high purity degree by a combination of two chromatographic steps: molecular exclusion and reversed-phase high performance liquid chromatography. The Lys49 PLA2 toxin shows a dimeric state and a mass of 13868,2 Da determined by mass spectrometry. The primary structure characterization of CoaTx-II allowed to identify and classify the protein as a basic Lys49 PLA2 homologue. The toxin is constituted mainly by positively charged amino acid residues and displays high identity with others Lys49 PLA2s homologues, which have high isoeletric points. The CoaTx-II three-dimensional structure determined by molecular modeling shows all typical secondary structures of PLA2s from snake venoms and a conserved scaffold. Despite the enzymatic inactivity, in vivo CoaTx-II triggered extensive local muscular damage, characterized by increase in plasma creatine kinase and confirmed by morphological alterations evaluated by histological analyses, in addition to inflammatory activity evidenced by rat paw edema assay and elevation in pro-inflammatory cytokine IL-6. These biological activities result from mechanism independent of enzymatic activity. A peptide library designed according to CoaTx-II primary structure and C-terminal region of others PLA2s was obtained by solid phase peptide synthesis. The methodology adopted in this work (Fmoc-tBu) allowed the achievement of peptides with high purity degree and good yields. The biological evaluation of this library of molecules revealed that the C-terminal peptide (115-129) from CoaTx-II, as well as its modified derivatives and C-terminal from other PLA2s show interesting antibacterial activity against Gram-negative bacterias: Escherichia coli (E. coli ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa ATCC 27853; P. aeruginosa 31NM) and Gram-positives: Staphylococcus aureus (S. aureus BEC9393; S. aureus rib1). The positively-charged amino acid residues present in primary structure of these peptides play an important role in mediating of this activity and give insights into its action mechanism, which probably starts by electrostatic interactions. Therefore, our results evidenced that CoaTx-II plays a central activity as mediator (local myotoxic and inflammatory) of degenerative events associated with envenomation by Crotalus oreganus abyssus and demonstrated the antibacterial property of cationic synthetic peptides derived from primary structure of PLA2 toxins, which have potential to be used for design and development of new therapeutic strategies for combating multidrug-resistant bacteria
Subject: Fosfolipases A
Venenos de serpentes
Atividade biológica
Crotalus oreganus abyssus
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2016
Appears in Collections:IB - Tese e Dissertação

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