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Type: TESE DIGITAL
Title: Rastreamento de variantes genéticas em neoplasias mieloides familiares por sequenciamento do exoma
Title Alternative: Screening of genetic variants in familiar myeloid neoplasms by exome sequencing
Author: Ferreira Filho, Moisés Alves, 1987-
Advisor: Saad, Sara Teresinha Olalla, 1956-
Abstract: Resumo: Até recentemente, as alterações genéticas relacionadas à patogênese das síndromes mielodisplásicas, neoplasias mieloproliferativas e leucemia mieloide aguda eram em grande parte desconhecidas. A introdução das tecnologias de sequenciamento de nova geração na investigação dessas doenças tem fornecido valiosas contribuições na identificação de novos biomarcadores moleculares, no estabelecimento de classificações de risco mais precisas, acompanhamento da evolução clonal das células neoplásicas e seleção de intervenções terapêuticas mais específicas. Este trabalho teve como objetivo identificar, por meio de sequenciamento do exoma, variantes genéticas específicas em casos de neoplasias mieloides com apresentação atípica ou com mais de uma ocorrência na mesma família. Pacientes de três diferentes famílias foram selecionados para o estudo: no caso 1, duas irmãs com mielofibrose primária e histórico de exposição de longa data a agrotóxicos do tipo DDT; no caso 2, uma paciente diagnosticada aos 21 anos de idade com síndrome mielodisplásica (SMD ¿ CRMD), doença esta com idade média de apresentação aos 70 anos de idade; e no caso 3, um pai com SMD de alto risco prognóstico e dois filhos com trombocitopenia periférica e atipias celulares na medula óssea. Para a pesquisa de variantes nesses pacientes, procedeu-se ao sequenciamento completo do exoma na modalidade estrito, em plataforma HiSeq 2500 (Illumina, Inc.), de amostras de DNA provenientes de células-tronco hematopoiéticas da medula óssea (CD34+) e células de linhagem germinativa do sangue periférico (linfócitos T CD3+). As análises em bioinformática dos dados do sequenciamento foram conduzidas segundo protocolo estabelecido pelo LaCTAD ¿ Unicamp, com o auxílio das seguintes feramentas: NGSQCToolkit, BWA, SAMtools, GATK e ANNOVAR. Tais programas foram aplicados, respectivamente, na filtragem das leituras por qualidade, alinhamento das leituras, remoção de duplicatas dos resultados de alinhamento, identificação e anotação de variantes. As variantes anotadas em conjuntos de genes implicados direta ou indiretamente na patogênese das doenças neoplásicas mieloides foram filtradas de acordo com a sua localização no genoma e com os valores de cobertura atingidos. Após as filtragens, as variantes remanescentes foram avaliadas quanto ao potencial deletério por meio do programa SIFT e quanto à patogenicidade pelo software PolyPhen2 e selecionadas para investigação futura de acordo com critérios de patogenicidade e baixa frequência em todas as populações combinadas (global minor allele frequency < 1%). No caso 1, filtragens em genes implicados na patogênese das neoplasias mieloides identificaram as variantes GATA1 Thr263Met na medula óssea (MO) e no sangue periférico (SP) de ambas as pacientes (III-2 e III-3) e JAK3 Val718Leu na medula óssea da irmã mais jovem (III-3). Foram identificadas ainda três variantes em genes que codificam enzimas metabolizadoras de drogas: CYP3A5 Gly31fs, CYP2A6 Ser467Stop e CYP2B6 Thr67Met. A alteração em GATA1, particularmente, não contém registro em bancos de dados de variantes até o momento. Por isso, predições moleculares da proteína GATA1 foram conduzidas e demonstraram que a treonina (T263) afetada pela inserção da variante está localizada no domínio dedo de zinco C-terminal e, portanto, em região funcional e altamente conservada dessa proteína. No caso 2, três variantes obedeceram aos critérios de seleção para investigação futura: ATM Pro1054Arg, RAD51C Thr287Ala e FANCB Gly335Glu (neste último, GMAF = 3,66%), todas presentes na MO e SP da paciente II-1, o que sugere que estas alterações tenham sido herdadas. Essas três variantes foram detectadas em três genes distintos que têm em comum função de reparo de danos ao DNA, de modo que mutações neles localizadas podem estar relacionadas a um risco aumentado para SMD e outros distúrbios mieloides. No caso 3, apenas duas variantes foram selecionadas para validação: ATM Ser333Phe, presente na MO e SP dos três pacientes sequenciados e PAPD5 Val572insSer (ou Val525insSer), na MO do pai (I-2) e do filho mais jovem (II-3) e no SP do pai. Tais resultados apontam que apenas a ATM Ser333Phe foi herdada nos pacientes avaliados do caso 3. Todas as variantes selecionadas serão validadas por meio de testes como sequenciamento de Sanger e estudos funcionais. Estudos de ligação familiar (linkage) nos demais indivíduos das famílias contempladas por este estudo também serão conduzidos

Abstract: Until recently, the genetic changes related to the pathogenesis of myelodysplastic syndromes, myeloproliferative neoplasms and acute myeloid leukemia were largely unknown. The introduction of next generation sequencing technologies in research of these diseases has provided valuable contributions on the identification of new molecular biomarkers, establishing more accurate risk ratings, the monitoring clonal evolution of cancer cells and selection of more specific therapeutic interventions. This study aimed to identify, through exome sequencing, specific genetic variants in cases of myeloid neoplasms with atypical or with more than one occurrence in the same family. Patients from three different families were selected for the study: in the case one, two sisters with primary myelofibrosis and history of longtime exposure to pesticides DDT type; in the case 2, one patient diagnosed at 21 years old with myelodysplastic syndrome (MDS - RCMD), a disease whose average age of presentation is 70 years old; and in case 3, a father with SMD high risk prognosis and two brothers with peripheral trombicitopenia and atypical cells in the bone marrow. To investigate the variations in these patients, we proceeded to complete sequencing of the exome in strict mode at HiSeq 2500 platform (Illumina, Inc.) from DNA samples of hematopoietic stem cells from bone marrow (CD34 +) and germline cells from peripheral blood (CD3 + lymphocytes). The bioinformatics analysis of sequence data were conducted according to the protocol established by LaCTAD - Unicamp, with the help of the following tools: NGSQCToolkit, BWA, SAMtools, GATK and ANNOVAR. Such programs were applied, respectively, for the filtering of reads by quality, alignment of the reads, removal of duplicates from alignment results, identification and annotation of variants. The variants annotated in groups of genes involved directly or indirectly in the pathogenesis of myeloid neoplasms were filtered according to their location in the genome and the achieved coverage values. After filtering, the remaining variants were evaluated as to their deleterious potential by SIFT and to the pathogenicity by PolyPhen2 software and selected for further investigation in accordance with pathogenicity criteria and low frequency in all the combined populations (global minor allele frequency <1%). In the case 1, filterings of genes implicated in the pathogenesis of myeloid neoplasms identified the GATA1 Thr263Met variant in bone marrow and peripheral bloodof both patients (III-2 and III-3) and JAK3 Val718Leu in the bone marrow of the younger sister (III-3). They also identified three variants in genes encoding drug-metabolizing enzymes: CYP3A5 Gly31fs, CYP2A6 Ser467Stop and CYP2B6 Thr67Met. The change in GATA1, particularly, contains no record in variants of databases to date. Therefore, GATA1 molecular predictions of protein were conducted and showed that Threonine (T263) affected by the insertion of the variant is located in the C-terminal zinc finger domain and therefore, in functional and highly conserved region of this protein. In the case 2, three variants comply with the selection criteria for future research: ATM Pro1054Arg, RAD51C Thr287Ala and FANCB Gly335Glu (in the latter, GMAF = 3.66%), all present in BM and PB of the patient II-1, which suggests that these changes have been inherited. These three variants were detected in three different genes that have a common function in the repair of DNA damage, so that mutations located there can be associated with an increased risk of MDS and other myeloid disorders. In the case 3, only two variants were selected for validation: ATM Ser333Phe present in BM and PB of the three sequenced patients and PAPD5 Val572insSer (or Val525insSer), the father MO (I-2) and younger son (II-3) and the parent SP. These results indicate that the only ATM Ser333Phe was inherited in the evaluated patients of the case 3. All selected variants will be validated through testing as Sanger sequencing and functional studies. Family linkage studies in other individuals of families covered by this study will also be conducted
Subject: Neoplasias hematológicas
Genética
Exoma
Language: Multilíngua
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2016
Appears in Collections:FCM - Tese e Dissertação

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