Please use this identifier to cite or link to this item: http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/321163
Type: TESE DIGITAL
Degree Level: Doutorado
Title: BMyb e a resposta das células epiteliais prostáticas às variações nos níveis de testosterona = BMyb and response of prostatic epithelial cells to testosterone levels variations
Title Alternative: BMyb and response of prostatic epithelial cells to testosterone levels variations
Author: Rosa-Ribeiro, Rafaela, 1987-
Advisor: Carvalho, Hernandes Faustino de, 1965-
Abstract: Resumo: Neste trabalho definimos a expressão e localização de fatores de transcrição que agem no controle de genes diferencialmente expressos na próstata ventral de ratos na ausência do andrógeno. Na primeira etapa, utilizamos análises de microarranjos de DNA, bioinformática e identificamos genes com função de reguladores da transcrição: EVI1 (Mecom), NFY, ELK1, GATA2, MYBL1, MYBL2 (BMYB), e membros da família NF?B que foram validados por imunofluorescência e qRT-PCR (Rosa-Ribeiro, Nishan, et al., 2014). Na segunda etapa, procuramos caracterizamos Bmyb na próstata ventral de ratos após a castração e também BMYB e em linhagens celulares humanas. Vimos que a expressão de Bmyb teve um aumento de cinco vezes no conteúdo relativo de RNAm e presença da sua forma ativa (fosfo-T487-BMYB) no núcleo das células epiteliais de próstata ventral de ratos três dias após a castração. Identificamos que as células LNCaP (células epiteliais de câncer de próstata humanas) expressam BMYB e as escolhemos para testar como o estímulo androgênico modula a expressão, ativação e interação de BMYB com o genoma/cromatina. Células LNCaP foram tratadas com R1881 (andrógeno sintético) 1 nM ou veículo (DMSO) por 6, 12 e 24 horas. Observou-se que o tratamento com R1881 por 12 horas resultou em diminuição da expressão de BMYB (qRT-PCR), e também em redução da forma fosforilada em T487 (Western Blotting), embora tenha o conteúdo aumentado ao longo do ciclo celular e acúmulo acentuado durante a mitose (imunofluorescência). Dupla marcação por imunofluorescência revelou que a ativação de AR por R1881 resulta em seu acúmulo no núcleo promove exclusão de fosfo-T487-BMYB. Para investigar aspectos da interação entre BMYB com cromatina de células LNCaP, submetemos o grupo de 12h tratado com R1881 e o grupo controle a técnica de ChIP-seq. As regiões de ligação de BMYB (picos) identificadas apresentaram características distintas e similares entre os dois grupos experimentais. Como imaginado, o motivo de ligação para BMYB foi encontrado enriquecido nas duas condições, porém, no grupo controle foi localizado também uma seqüência não-canônica para BMYB. Além dos motivos para BMYB, foram encontrados motivos de ligação enriquecidos para SMAD2, STAT5, STAT6 e ZFX nos dois grupos enquanto NKX2.5 e ZNF711 exclusivamente nos grupos controle e R1881, respectivamente. A presença dos motivos para BMYB nos picos, possui uma distribuição que respeita a "lei de potência" mostrando que picos com mais motivos de ligação são regiões bastante grandes e localizadas próximas ao TSS dos genes mais próximo sugerindo a formação de "campos de atividade". Considerando somente a região próxima ao TSS, há uma frequência maior de picos no grupo R1881. Com relação presença de BMYB nos cromossomos, ele tem uma distribuição similar nos dois grupos e preferencia pela região centromérica. Os genes com TSS mais próximo aos picos de BMYB, são em sua maioria "genes codificadores de proteínas" nos dois grupos. Já a respeito das regiões no genoma a localização de picos é preferencialmente em regiões "intergênicas" com exclusividade de regiões para R1881 em regiões "5¿UTR", "3¿UTR" e "Exon" dos genes. As ontologias que esses genes configuram (10 vs 55, para controle e R1881, respectivamente) são distintas para as duas condições experimentais e se referem a funções variadas considerando "biological process". Além disto, comparando os genes encontrados pelo ChIP-seq com transcriptomas da literatura, encontramos que 5% dos genes são os mesmos pelas duas abordagens e que genes como KLK3, KLK2, TMSRPS22 e NKX2.5 relacionados a biologia da próstata, estão presentes no grupo R1881. Em conclusão, os resultados obtidos são inéditos e demonstram que BMYB executa funções compatíveis com a regulação diferencial da estrutura da cromatina em diversas escalas, nos estados androgênico e hipoandrogênico

Abstract: In this work we have defined the expression and localization of transcription factors related to control of differentially expressed genes by rat ventral prostate under androgen deprivation. In the first part, using DNA microarray, bioinformatics we have identified genes with annotated function in transcription regulation: EVI1 (Mecom), NFY, ELK1, GATA2, MYBL1, MYBL2, and NF?B member family wich were validated through immunofluorescence and qRT-PCR (Rosa-Ribeiro, Nishan, et al., 2014). In the second part, we characterize Bmyb in the rat ventral prostate after castration and BMYB in prostate human cell lines. We observed that expression of Bmyb has had a five-fold increase in mRNA content and the presence of its active form (phospho-T487-BMYB) in the epithelial cell nuclei in the rat ventral prostate three days after castration. We identified that LNCaP cells (isolated from human prostate cancer epithelial cell) express BMYB and chose theses cells to test the effects of androgen stimulation on BMYB activation and interaction with the genome/chromatin. LNCaP cells were incubated with either 1 nM R1881 (a synthetic androgen) or the vehicle (DMSO) for 6, 12 or 24 hours. Treatment with R1881 for 12 hours resulted in decreased expression of BMYB (qRT-PCR), reduced content of phospho-T487-BMYB (Western Blotting), although we have shown that the content of this phosphorylated form increases along of cellular cycle and accumulates in mitotic cells (immunofluorescence). Double immunofluorescence revealed that AR activation for R1881, accumulates AR in the nucleus by R1881 and excludes phospho-T487-BMYB. To investigate aspects of BMYB interaction with the chromatin in LNCaP cells, submitted the 12h control and treated with R1881 groups to ChIP-seq. The binding regions of BMYB (peaks) identified by ChIP-seq showed distinct and similar aspects between the two experimental groups. How expected, the BMYB binding motif was found enriched in both groups, however, in the control group was also localized the non-canonical sequence to BMYB. Besides BMYB motifs, it was found enrichment motif to SMAD2, STAT5, STAT6 and ZNFX in both groups, while NKX2.5 and ZNF11 were found in control and R1881 groups, respectively. The presence of BMYB motif through the peaks, has a distribution that respect the "power law" showing that peaks with high BMYB motif concentration are huge regions near to TSS suggesting a formation of "activity fields". Analyzing regions near TSS, there is a high frequency of peaks in R1881 group. Despite of BMYB chromosome distribution, its has similar distribution in both groups and preferably centromeric occupation. The genes with closest TSS of BMYB peaks, are mostly "protein coding" in both groups. While in gene regions there is a preferential binding to "intergenic" region with exclusive regions to R1881 in "5¿UTR", "3¿UTR" and "Exon" of genes. The ontologies (10 vs 55, for the control and R1881, respectively) are distinct for each experimental condition and refer to different functions considering to transcriptomes from literature, was found that 5% of genes are the same; and gene like: KLK3, KLK2, TMPRSS22 and NKX2.5, strongly related to prostate biology, were found in R1881 group. In conclusion, the results are novel and demonstrate that BMYB patterns of genome occupation are compatible with its function in determining different chromatin structures in different scales in the androgenic and hypoandrogenic environments
Subject: Prostata
Proteína B relacionada a Myb
Andrógenos
Cromatina
ChIP-seq
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2016
Appears in Collections:IB - Tese e Dissertação

Files in This Item:
File SizeFormat 
Rosa-Ribeiro_Rafaela_D.pdf13.67 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.