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Type: TESE DIGITAL
Title: Avaliação da expressão de genes candidatos em sistema de RNA interferente (RNAi) em Diaphorina citri (Kuwayama) (Hemiptera: Liviidae), vetor do huanglongbing do citros = Evaluation of candidate genes expression in RNA interfering system (RNAi) in Diaphorina citri (Kuwayama) (Hemiptera: Liviidae), vector of citrus huanglongbing
Title Alternative: Evaluation of candidate genes expression in RNA interfering system (RNAi) in Diaphorina citri (Kuwayama) (Hemiptera: Liviidae), vector of citrus huanglongbing
Author: Galdeano, Diogo Manzano, 1983-
Advisor: Machado, Marcos Antônio
Abstract: Resumo: O psilídeo Diaphorina citri (Kuwayama) tornou-se nos últimos anos um dos mais importantes vetores na cultura de citros, em função dos crescentes prejuízos causados às plantas pela transmissão das bactérias Candidatus Liberibacter americanus e Candidatus Liberibacter asiaticus, agentes causais do huanglongbing (HLB) dos citros. O manejo do HLB é baseado no uso de mudas sadias, erradicação de plantas infectadas e pelo controle químico do vetor. No entanto, o uso contínuo e intenso de inseticidas é problemático, não só pelos custos financeiros, como também pelos problemas ambientais que o uso excessivo acarreta. Para reduzir os altos custos no desenvolvimento de novos inseticidas e tornar o controle mais eficiente e específico, o silenciamento gênico por RNA de interferência (RNAi) é uma das promessas de novas tecnologias utilizadas no controle de pragas e vetores. Assim, os objetivos deste trabalho foram buscar genes candidatos a serem silenciados, estabelecer sistemas de fornecimento de moléculas de dupla fita de RNA (dsRNAs), avaliar a mortalidade e expressão dos genes candidatos a silenciamento de D. citri. Para isso, foi utilizado um sistema de alimentação in vitro composto por diferentes concentrações de sacarose para avaliar a sobrevivência de D. citri nos estágios de ninfa e adultos durante cinco dias. Foi realizada a busca de 16 genes candidatos no transcriptoma e genoma de D. citri. Depois da confirmação das sequências, os genes inhibitor of apoptosis, trehalase, cathepsin D, cathepsin L, chitin synthase, Na+/K+ ATPase subunit-A e ATP synthase subunit-D like mitochondrial foram selecionados para serem transcritos in vitro e três diferentes concentrações de dsRNAs (200, 500 e 1000 ng.?L-1) de cada gene foram incorporadas em dieta artificial para insetos adultos. Também foi elaborado um sistema de fornecimento de dsRNAs de inhibitor of apoptosis, cathepsin D e chitin synthase via ramos de Murraya spp. para avaliar os efeitos de RNAi em ninfas. Nos ensaios de ingestão de dsRNAs via dieta artificial e ramos de murta foram avaliados a taxa de mortalidade e expressão gênica dos insetos, e também, a estabilidade dos dsRNAs. As concentrações 15 e 30% de sacarose no sistema de alimentação in vitro foram as que apresentaram maiores taxas de sobrevivência de D. citri adultas das populações estabelecidas no Centro de Citricultura `Sylvio Moreira¿/IAC e na Universidade da Califórnia-Davis, respectivamente. Após cinco dias, as taxas de mortalidade nos testes de fornecimento de dsRNAs dos genes alvos de D. citri em dieta artificial variaram entre 21-48%, 28-51% e 37-63%, nas concentrações 200, 500 e 1000 ng.?L-1, respectivamente. As taxas de sobrevivência de ninfas no sistema de fornecimento de dsRNAs de inhibitor of apoptosis, cathepsin D e chitin synthase via planta foram de 40, 71 e 50%, respectivamente. As moléculas de dsRNAs foram estáveis nos sistemas de fornecimento avaliados. Além disso, reduções nos níveis de expressão dos genes alvo de D. citri nos ensaios de RNAi foram confirmadas por PCR em tempo real. Estes dados sugerem métodos de fornecimento de dsRNAs, dieta artificial e ramos de murta, são ferramentas úteis para estudos de função gênica e possível controle de D. citri

Abstract: In early years, the Asian citrus psyllid, Diaphorina citri (Kuwayama) has become one of the most important vectors in citrus, due to the increasing damage caused to plants by bacteria transmission, Candidatus Liberibacter americanus and Candidatus Liberibacter asiaticus, causal agents of citrus huanglongbing (HLB). Healthy seedlings, eradication of infected plants and the chemical control of the vector have been used as HLB control strategies. However, the use constant and intensive of insecticides is not a good strategy, not only to the financial costs but also to the environmental problems. To reduce the high costs in development the new insecticides and making the control more efficient and specific, the gene knockdown by RNA interference (RNAi) is one of the promises of new technologies used in the control of pests and vectors. The aims of this study were to development double-stranded RNA (dsRNAs) delivery systems, searching candidate genes to be knockdown, evaluate the mortality and gene expression of D. citri. Thus, an in vitro feeding system composed of different sucrose concentrations was used to evaluate the nymph and adult D. citri survival for five days. After that, sixteen candidate genes were searching in transcriptome and genome D. citri. After confirmation of gene sequences, inhibitor of apoptosis, trehalase, cathepsin D, cathepsin L, chitin synthase, Na+/K+ ATPase subunit-A e ATP synthase subunit-D like mitochondrial genes were selected to be transcripts in vitro, and three different dsRNAs concentrations (200, 500 e 1000 ng.?L-1) of each gene were put in artificial diet to adult insects. Moreover, a dsRNAs (inhibitor of apoptosis, cathepsin D chitin synthase) delivery system by Murraya spp. leaves was development to evaluate the RNAi effects in nymphs. Mortality rates and gene expression of D. citri were evaluated after feeding dsRNAs via artificial diet and Murraya spp., and also, the dsRNAs stability in both delivery systems were evaluated. Fifteen and thirty percent sucrose in vitro feeding system showed the highest survival rates of adult D. citri populations from Citrus Center 'Sylvio Moreira' /IAC and University of California-Davis, respectively. After five days, the D. citri mortality rates in the dsRNAs delivery system of target genes on artificial diets ranged from 21-48%, 28-51% and 37-63% at concentrations of 200, 500 and 1000 ng.?L-1, respectively. Nymphs survival rates in the delivery system of inhibitor of apoptosis, cathepsin D and chitin synthase dsRNAs via plant leaves were 40, 71 and 50%, respectively. DsRNAs molecules were stable in the delivery systems evaluated. Furthermore, reduction in target gene expression levels of D. citri in the RNAi assays were confirmed by real time PCR. These datas suggest methods of providing dsRNAs, artificial diet and orange jasmine leaves, are useful tools for gene function studies and possible control of D. citri
Subject: Diaphorina citri
Interferência de RNA
Huanglongbing
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2016
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