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Type: DISSERTAÇÃO
Degree Level: Mestrado
Title: Aspectos morfologicos da apoptose induzida pelo tamoxifeno em linfocitos humanos cultivados in vitro
Author: Oliveira, Naila Francis Paulo de
Advisor: Dolder, Mary Anne Heidi, 1943-
Abstract: Resumo: Alguns fármacos apresentam potencial quimioterápico contra neoplasias, por inibirem a proliferação celular e induzirem a morte celular. Muitos desses agentes podem apresentar efeitos citotóxicos em tecidos normais como linfopenia, devido à indução de apoptose com diminuição das células T CD4, podendo levar a implicações na resposta imune. O tamoxifeno (T AM) é um agente não esteróide antiestrógeno utilizado como quimioterápico coadjuvante no tratamento de câncer de mama. Trabalhos recentes têm demonstrado que o T AM pode causar câncer endometrial em pacientes pós-menopausa, como sério efeito colateral. O presente trabalho objetivou investigar a capacidade do T AM de induzir apoptose em linfócitos humanos cultivados in vitro. Para tanto, amostras de sangue de voluntárias jovens (grupo A= 25 a 30 anos;n=3) e idosas (grupo B= 58 a 77 anos;n=3), foram centrifugadas em gradiente de densidade de Percoll (percoll-50%) para separação de linfócitos e monócitos. Os monócitos foram excluídos por cultura dependente de adesão por 2 horas. O sobrenadante contendo linfócitos controle foram cultivados em meio RPMI suplementado com 10% de soro fetal bovino por 24 e 48 horas, enquanto linfócitos, denominados tratados, receberam 20J.1M de T AM no meio de cultura. Após a cultura, as células foram: 1) contadas em hemocitômetro, sendo estipulado a porcentagem de células viáveis para o total de células analisadas, utilizando-se o método de exclusão pelo Azul Tripan; 2) incubadas com anexina-biotina, que possui alta afinidade pela fosfatidilserina, seguido de incubação com anti-biotina conjugada à fluoresceína, para marcação das células em apoptose e analisadas ao microscópio de fluorescência; 3) fixadas em formaldeído e coradas com Leishman para estudos em microscopia de luz (ML); 4) depositadas em lamínulas, fixadas em glutaraldeído seguido de pós-fixação com tetróxido de ósmio e analisadas ao microscópio eletrônico de varredura (MEV); 5) fixadas em solução de glutaraldeído, ácido pícrico e formaldeído seguido de pós-fixação com tetróxido de ósmio e analisadas ao microscópio eletrônico de transmissão (MET); 6) a análise estatística foi realizada a partir de análise de variância one-way ANOV A com p< 0,05. As culturas tratadas demonstraram menor viabilidade celular e maior índice apoptótico que seus controles. Ainda, culturas controle e tratadas de linfócitos de mulheres idosas apresentaram maior porcentagem de células em apoptose quando comparadas com linfócitos de mulheres jovens. Os estudos em ML e MET revelaram maior condensação cromatínica e redução do volume celular, e ainda, ao MET foram observados vacúolos autofágicos no citoplasma. A MEV revelou células com perda de microvilosidades e perda da morfologia arredondada após 48 horas de tratamento. Conclui-se, então que os linfócitos foram afetados pelo tratamento com o TAM em ambos os grupos, embora o grupo de mulheres idosas se mostrou mais susceptível a apoptose

Abstract: Some drugs have a chemotherapic potential against neoplasms, through inhibition of proliferation and cell death induction. Many of these agents can display cytotoxic effects in normal tissues such as lymphopeny due apoptosis induction with a consequent decrease of T CD4 cells and its implications in the immune response. Tamoxifen is a synthetic non steroidal antiestrogenic drug which is currently being widely employed in the treatment of female breast cancer. Recent studies have shown that TAM can cause endometrial cancer in postmenopausal patients, considered a serious side effect. The purpose of this work was to investigate the capacity of T AM to induce apoptosis in human lymphocytes cultivated in vitro. Samples of peripheral blood were obtained from young (group A= 25-30 years 0Id;n=3) and old (group B= 58-77 years 01d;n=3) women and centrifuged in a Percoll density gradient, to separate lymphocytes and monocytes (percoll-50%). Monocytes were excluded by culturing for 2 hours. The supernatant with control lymphocytes was cultivated in RPMI containing 10% fetal bovine serum, for 24 and 48 h as controls, whereas treated lymphocytes received TAM (20JlM) added to the culture medium. After the culture, the cells were: 1) counted in a hemocytometer, and the viable cell number for each sample was obtained through an exclusion test of intact cells by using 1 % Tripan Blue and establishing the percentage of unstained, alive cells for the total of ressuspended cells; 2) incubated with annexin-biotin, which has high affinity for phosphatidilserine (PS), followed by incubation with FITC conjugated anti-biotin, to target apoptotic cells and examined by fluorescence microscopy; 3) fixed in formaldehyde and stained with Leishman and examined by light microscopy (LM); 4) placed on coverslips, where the cells were fixed, post fixed in osmium tetroxide and examined with the scanning electron microscope (SEM); 5) fixed in in glutaraldehyde, formaldehyde and picric acid, post fixed in osmium tetroxide, and examined in a transmission electron microscope (TEM); 6) statistical analysis was performed using one-way analysis of variance (ANOV A) with p< 0.05. The treated cultures showed less viable cells and more apoptotic cells than control cultures. Moreover, group B showed more apoptotic cells in comparison with group A, in both control and treated cultures. LM and TEM showed treated cells with more condensed chromatin and reduction of cell volume. In TEM some autophagic vacuoles in the cytoplasm were observed. SEM showed loss of microvilli and loss of spherical shape at 48 h, when compared with the controls. Thus, a response to TAM was observed in both groups, although group B was more susceptible to apoptosis
Subject: Biologia celular
Linfócitos
Morfologia
Language: Português
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2003
Appears in Collections:IB - Tese e Dissertação

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