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Type: TESE
Degree Level: Doutorado
Title: Identificação de transcritos de Ceriporiopsis subvermispora expressos nas fases iniciais da biodegradação da madeira
Title Alternative: Identification of transcripts of Ceriporiosis subvermispora expressed during initial phases of wood biodegradation
Author: Macedo, Maria Lucila Hernandez
Advisor: Mello, Maricilda Palandi de
Abstract: Resumo: Ceriporiopsis subvermispora é um basidiomiceto classificado como white-rot, que apresenta alta seletividade de degradação da lignina quando crescido em madeira. De maneira geral, existem três tipos de enzimas lignolíticas: manganês peroxidases (MnP), lignina peroxidases (LiP) e lacases. Estas enzimas atuam degradando estruturas fenólicas e não fenólicas da lignina. Até o momento, acredita-se que o sistema ligninolítico do fungo C. subvermispora seja composto por isoenzimas da família MnP e de lacases, pelo fato da atividade de LiPs não ter sido identificada, embora possua genes desta classe de enzimas. Diferentes estudos têm sido conduzidos como sistemas modelo de ligninólise, com diferentes linhagens de C. subvermispora e outros fungos white-rot visando uma possível aplicação da ligninólise biológica na biopolpação e na indústria de papel. Apesar da importância promissora do fungo C. subvermispora na aplicação industrial, o metabolismo celular e o sistema extracelular que esse organismo utiliza para decompor a madeira ainda não estão bem esclarecidos. Embora os estudos de atividades de enzimas extracelulares e de seus produtos gerem muitas informações a respeito dos mecanismos de ação de fungos lignolíticos, há necessidade de se integrar a estas informações resultados de expressão gênica durante o processo de biodegradação. Com isto este trabalho tem como objetivo contribuir com estudos moleculares do fungo durante a decomposição das madeiras de Pinus taeda e Eucalyptus grandis em pontos selecionados durante o período de 5 a 60 dias de crescimento. Para a caracterização de genes, foram obtidos rnRNAs de cada estágio de crescimento e submetidos às técnicas de RT-PCR e Display Diferencial. Foram utilizados dois primers ancoradores T12NC e T12NG, assim como três primers aleatórios (OPJ01, OPJ04, OPJ1O). Noventa e um fragmentos diferenciais foram visualizados em autorradiografias de géis de onde foram isolados, clonados e seqüenciados. As seqüências obtidas foram submetidas à analise por comparação de homologias em bancos de dados utilizando o programa BLASTX versão 2.2.14 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)Para a confirmação da expressão diferencial das seqüências com similaridade a proteínas envolvidas na degradação da madeira, foi utilizada a metodologia de PCR em tempo real. Três genes relacionados no processo de biodegradação foram encontrados, oxalato oxidase, celobioidrolase e manganês super oxido desmutase. Oxalato esta envolvido na produção de peróxido de hidrogênio que é utilizado como co-substrato para a ação de MnP. O radical superóxido desmutase reduz Mn+2, também originando peróxido de hidrogênio que atua na formação de Mn +3 capaz de oxidar compostos fenólicos e não fenólicos dos componentes da lignina. Já a celobioidrolase esta envolvida na cIivagem da cadéia terminal de polissacarídeos que compõem a celulose. O padrão de expressão observada por RT-PCR quantitativo mostrou que os genes de oxalato e superóxido desmutase foram altamente expressos durante os primeiros 15 dias de cultivo na madeira de P. taeda e nos períodos de 40 a 60 dias em E. grandis. Já a celobioidrolase apresentou maior expressão no décimo dia de cultivo nas duas madeiras. De modo geral estes resultados correlacionam-se a análise da atividade enzimática dos extratos de cultura do fungo em P. taeda e E. grandis

Abstract: Lignin is a heterogeneous and highly cross-linked macromolecule that is particularly resistant to biological degradation but some specialized fungi developed the ability to degrade this complex molecule. Most of these fungi belong to the basidiomycetes and are responsible for the white-rot decay processo One of them, Ceriporiopsis subvermispora, has been extensively studied due to its potential applicability in industrial processes. Ceriporiopsis subvermispora is a white-rot fungus that shows high selectivity towards lignin degradation through a mechanism composed mainly by maganese-dependent peroxidase (MnP) and lacase. Both activities are secreted as isoenzyme farnilies, with isoelectrofocusing patterns that vary according to the composition of the growth media. Although the industrial applicability of this fungus has been recognized, its biochemical and rnolecular lignolytic processes are not completely understood. The present study provides additional data for evaluating the molecular processes involving the first steps of wood biodegradation by C. subvermispora cultivated in Pinus taeda and Eucalyptus grandis for periods ranging from 5 to 60 days. U sing the differential display reverse transcription PCR technique (DDRT-PCR), a total of 91 differentially expressed cDNA fragments were identified by comparing band intensities among fingerprints obtained with rnRNA from cultivated mycelia. Sixty-one differential fragments were sequenced and identified by alignment analysis with GenBank sequences using the BLASTX function. Three . genes oxalate oxidas e, manganese superoxide desrnutase and cellobiohydrolase, derivates ITom biodegradation by C. subvermispora on Pinus taeda wood chips culture, were analysed and compared the expression in Eucalyptus grandis culture. Oxalate and superoxide dismutase genes were expressed during the first growth period (to 15 days) in P. taeda cuIture and 40-60 days in E. grandis wood. On the other hand cellobiohydrolase gene showed high expression at 10 day culture in both wood. This results are correlate with C. subvermispora enzymatic activities during biopulping of P. taeda e E. grandis
Subject: Biodegradação
Lignina
Expressão gênica
Fungos
Language: Português
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2006
Appears in Collections:IB - Tese e Dissertação

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