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Type: TESE
Title: Conteudo, biossintese e degradação de acido hialuronico na prostrata ventral de ratos : efeito da castração e papel das celulas musculares lisas
Author: Della Colleta, Heloisa Helena Mithie
Advisor: Carvalho, Hernandes Faustino de, 1965-
Abstract: Resumo: O hialuronam (ou ácido hialurônico, AR) é um importante componente do espaço matrice1ular, estando presente tanto na matriz extracelular, como na superficie das células. Suas funções são variadas, mas estão sempre associadas à criação de um espaço pouco denso e extremamente hidratado, permitindo a proliferação e migração celular, típicas de processos como a embriogênese, cicatrização e invasão tumoral. Neste trabalho foi desenvolvido um estudo do metabolismo do ácido hialurônico na próstata ventral de ratos. Numa primeira etapa foi verificado o efeito da castração por 7, 14 e 21 dias sobre. o conteúdo e distribuição do AR, assim como uma avaliação do papel da HA. sintase 2 (HAS2) e da hialuronidase 1 (Hyall). Para tanto, foram empregados ensaios de marcação tecidual de AH com a utilização de sonda marcada com fluoresceína, quantificação deAH por ensaio competitivo, determinação dos tamanhos das cadeias de AH por cromatografia em gel filtração, determinação dos níveis de expressão das enzimas HAS2 e Hyall por Real Time PCR, localização desta expressão por hibridação in situ e localização do receptor CD44 por imunohistoquímica. Na segunda etapa, foram estudadas células musculares lisas (CML) isoladas de ratos e mantidas em cultura, quanto à expressão de marcadores da diferenciação deste tipo celular e quanto à produção de AH, utilizando. imunocitoquímica e RT-PCR para marcadores de CML, imunocitoquímica para o receptor CD44, quantificação de AH por ensaio competitivo e por medida de área de coat. Os resultados demonstram que o AR é encontrado tanto no epitélio quanto no estroma prostático e que há uma redução no conteúdo total de AR na próstata ventral, com um predomínio de cadeias curtas. Além disto, foi verificado que estas modificações são, ao menos em parte, devidas à manutenção da expressão da HAS2 e um aumento na expressão da Hyall. Foi observado também, por outro lado, que ocorre uma diminuição na atividade da hialuronidase lisossomal. Experimentos de hibridação in situ demonstraram a presença da HAS2 no epitélio e em diversas células do estroma, com exceção das células musculares lisas e endoteliais. Com a castração, a expressão da HAS2 e da Hyall aumenta no estroma. Foi demonstrado também que as células musculares lisas prostáticas de rato em cultura mantêm a expressão de marcadores da diferenciação (smoothelin, SM22 e calponina) e que esta expressão não foi dependente de insulina-nemtestosterotta. A concentração de ácido hialurônico no meio de cultura variou nas diferentes passagens (0-8), assim como variou o tamanho do coa! ao redor das células. Surpreendentemente, nas passagens 3 e 4 houve uma queda brusca na síntese de HA Os- resultados demonstram uma modificação no padrão expressão e de distribuição do ácido hialurônico na próstata ventral de ratos, com o comprometimento de diversos tipos celulares, que resultam na diminuição do conteúdo total. Conclui-se também que células musculares lisas em cultura mantêm-se diferenciadas e que são capazes de sintetizar e formar um coa! na sua superficie

Abstract: Hyaluronan (or hyaluronic acid, HA) is an important component ofthe matricellularspace. It is found in both extracelular matrix and at the cell surface. It has many functions, but is always associated with the establishment of a looser and hydrated space, allowing the cells to proliferate and migrate, in processes such as embryogenesis, healing and tumor invasion. In this work, we have studied some aspects ofHA metabolism in the rat ventral prostate. In a firt series of experiments, the effect of castration for 7, 14 and 21 days on the content and distribution of HA, as well as an evaluation of the function of HA synthase 2 (HAS2) and hyaluronidase 1 (Hyall). For this, were done tecidual HA localization with fluorescein probe, measurement of HA content in a competitive binding assay, determination of HA chain size variation using gel filtration cromatography, determination of expression levels ofHAS2 and Hyall enzymes by Real Time PCR, localization ofthese expression by in situ hybridization and CD44 localization by immunohistochemistry. In a second series of experiments, the rat prostatic smooth musc1e cells (SMC) were isolated and maintainedin vitro for the study of the expression of molecular markers of the differentiated state and of the production of HA, using immunohistochemistry e RT-PCR for SMC markers, immunocitochemistry for CD44 receptor, HA quantification by competitive bindingassay and measurement of coat area. The results demonstrate that HA is found in both epitheJium and stroma and that there is a decrease in the total amount of HA in the organ afier castration, with a predominance of short chains. Besides, it was observed that these modifications are, at least in part, due to a sustained expression of HAS2 and an increased expression of Hyall. On the other hand, a reduction in lysosomal hyaluronidase activity was also observed. In situ hybridization showed the presence of HAS2 mRNA in both epithelium and stroma. Different stromal cells, with the exception of SMC and endothelial cells, expressed HAS2. Castration resulted in increased expression of HAS2 and Hyall in the stroma. It was also demonstrated that SMC kept inculture express the differentiation markers smoothelin, SM22 and calponin and that this expression pattern was not dependent on either insulin or testosterone. The concentration of HA in the culture medium and the size of the cell coat varied as cells were subcultured through passages 0-8. Surprisingly; a severe drop in HA synthesis was observed at passages 3 and 4. The results demonstrate a modification in the pattem of expression and distribution of HA in the rat ventral prostate in response to castration, and the involvement of different cell types in the decreasing amount ofHA. lt is also concluded that SMC preserve the differentiated state in culture and that they are able to assemble a HA coat
Subject: Prostrata
Ácido hialurônico
Castração
Miócitos de músculo liso
Reação em cadeia da polimerase em tempo real
Language: Inglês
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2005
Appears in Collections:IB - Tese e Dissertação

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