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Type: DISSERTAÇÃO DIGITAL
Degree Level: Mestrado
Title: Identificação de elementos cis-regulatórios putativos para os genes Dact - implicações na descoberta da expressão de Dact1 no pâncreas
Title Alternative: Identification of putative cis-regulatory elements for Dact genes - implications of Dact1 discovery in pancreas
Author: Janousek, Ricardo Guerreiro, 1987-
Advisor: Solferini, Vera Nisaka, 1957-
Abstract: Resumo: As proteínas da família DACT modulam as vias de sinalização Wnt e TGF-ß e, por meio delas, atuam em processos metabólicos essenciais à manutenção da vida, como a regulação da proliferação, diferenciação e migração celular, o comportamento de células-tronco, a homeostase e a regeneração tecidual, além do desenvolvimento do câncer. Buscamos compreender parte da regulação desta importante família gênica ¿ tópico ainda pouco estudado na literatura ¿ por meio da identificação e análise de elementos cis-regulatórios dos genes Dact ¿ tanto aqueles compartilhados por diferentes parálogos quanto dentre genes ortólogos. Neste estudo, postulamos uma nova implicação dos genes Dact no contexto pancreático e mostramos sua atuação, mediante a modulação destas vias de sinalização, tanto na formação quanto homeostase do órgão. A busca e identificação dos elementos cis-regulatórios foram realizadas por meio da comparação in silico dos diferentes loci Dact nos genomas humano, de camundongo e da galinha. Localizamos duas regiões evolutivamente conservadas (ECRs) entre parálogos Dact e avaliamos seus possíveis papéis funcionais; depois, identificamos e caracterizamos sítios putativos de ligação para fatores de transcrição que haviam sido conservados ao longo da evolução. Além disso, apresentamos dados de dezesseis ECRs relacionadas a um mesmo ortólogo Dact em espécies diferentes, possíveis coordenadoras da ação destes genes em contextos mais específicos. Na etapa seguinte, a arquitetura das dezoito ECRs identificadas em ambos os passos anteriores foi comparada, visando identificar uma estrutura comum entre as ECRs de diferentes espécies de vertebrados e que sugeriria funcionalidade conservada, não obstante possíveis alterações de sequência. Nesta etapa, identificamos uma ECR em especial, a qual, além de possuir forte padrão de conservação evolutiva, apontava para uma ação do gene Dact1 no contexto pancreático, ainda não descrita na literatura e possivelmente entrelaçando-o ao desenvolvimento do órgão e posterior homeostase dos processos metabólicos pancreáticos. Dadas as possíveis implicações desta descoberta para a compreensão do funcionamento do pâncreas ¿ um órgão fundamental à saúde humana e foco de doenças social e economicamente importantes, como o diabetes ¿, focamos nossos ensaios funcionais nesta ECR em particular. Aqui, mostramos, com os resultados de RT-PCRs, a expressão do gene Dact1 e de uma seleção de fatores de transcrição identificados in silico em células beta de camundongo e demais materiais pancreáticos. Ademais, a ECR em questão foi clonada em vetor de expressão contendo um promotor basal e um gene repórter e transfectada em cultura celular de INS-1 (células beta de rato) e HEK293-T para testes de expressão diferencial. Além de fornecer um mapa de sítios regulatórios putativos para os genes Dact, este estudo poderá contribuir de maneira significativa para a compreensão dos mecanismos que possibilitam uma atividade integrada destes genes durante a embriogênese de vertebrados, bem como na regulação da homeostase pós-natal, e inclui insights para posteriores trabalhos sobre a influência desta importante família gênica no desenvolvimento de doenças hoje epidêmicas, como a obesidade e o diabetes tipo 2

Abstract: The DACT protein family modulates Wnt and TGF-B signaling pathways and, through them, influence many metabolic processes essential to life, such as the regulation of cell proliferation, differentiation and migration, stem cell behavior, tissue homeostasis and regeneration, and the development of cancer. In this study, our goal was to better understand how this important gene family has it's expression regulated ¿ a topic still poorly discussed in scientific literature ¿ by identifying and analyzing cis-regulatory elements, both the ones shared among different paralogs and among Dact orthologs. We postulate new implications for DACT proteins in the pancreatic context and show how they may act in the formation and homeostasis of this organ. The search and identification of cis-regulatory elements were accomplished by in silico comparisons of distinct Dact loci in human, mouse and chicken genomes. We have localized two Evolutionarily Conserved Regions (ECRs) among Dact paralogs and studied them for possible functional roles; later, we identified and characterized putative binding sites for transcription factors conserved during vertebrate evolution. Moreover, we show here data for sixteen ECRs related to distinct Dact orthologs, which are possible candidates for coordinating these gene's expression and action in more exact contexts. In the next stage, the eighteen ECRs found in the above studies had their binding sites' architecture compared for the identification of common structures among ECRs of different vertebrate species, which might suggest conserved functionalities, sequences alterations notwithstanding. At this stage, we identified one ECR in particular which showed a strong conservation profile and suggested that Dact1 might by transcriptionally active in the pancreas ¿ a site so far never described for the gene in the literature ¿, possibly being active during the organ's development and necessary for adult metabolic homeostasis. Since the pancreas is a much studied and fundamental organ ¿ being related to essential biological processes for human health and socioeconomically important diseases, such as diabetes ¿, we have focused our studies in this ECR. In this dissertation, we show the expression of Dact1 and other transcription factors previously identified in our ECRs in pancreatic tissues and cells, via RT-PCRs. Furthermore, we show the results of differential gene expression experiments in which the ECR was cloned into an expression vector containing a basal promoter and a reporter gene, than transfected in INS-1 and HEK293-T cell cultures. This study provides maps for putative regulatory sites for the Dact genes and may significantly contribute to the comprehension of the mechanisms that allow an integrated activity of these genes during vertebrate embryogenesis and post-natal tissue homeostasis. It also includes insights for further studies trying to elucidate the Dact gene family's influence on now epidemic diseases, more specifically obesity and type 2 diabetes
Subject: Regulação da expressão gênica
Genética
Evolução
Genes Dapper
Pâncreas
Editor: [s.n.]
Citation: JANOUSEK, Ricardo Guerreiro. Identificação de elementos cis-regulatórios putativos para os genes Dact - implicações na descoberta da expressão de Dact1 no pâncreas. 2016. 1 recurso online ( 94 p.). Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: <http://www.repositorio.unicamp.br/handle/REPOSIP/317337>. Acesso em: 30 ago. 2018.
Date Issue: 2016
Appears in Collections:IB - Tese e Dissertação

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