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Type: TESE
Degree Level: Doutorado
Title: Avaliação dos efeitos de microambiente hipoxico em celulas dendriticas humanas infectadas com Leishmania amazonensis
Title Alternative: Effect of hypoxia on human denditic cells infection by Leishmania amazonensis
Author: Bosetto, Maira Cegatti
Advisor: Giorgio, Selma, 1962-
Abstract: Resumo: As células dendríticas (DCs) são potentes células apresentadoras de antígeno envolvidas principalmente na iniciação da resposta imune primária. As DCs podem ser isoladas a partir do cultivo de monócitos do sangue periférico humano realizado na presença de GM-CSF e IL-4. Protozoários do gênero Leishmania são parasitas intracelulares obrigatórios de células do Sistema Fagocítico Mononuclear como os macrófagos e as DCs. A L. amazonensis, espécie utilizada em nossos estudos, causa principalmente lesões cutâneas que podem se cronificar resultando num processo infeccioso com conseqüente hipóxia tecidual. Neste trabalho avaliamos o papel deletério/terapêutico da hipóxia em modelo in vitro de uma infecção intracelular, a leishmaniose, através da análise dos parâmetros comentados na seqüência. Culturas de DCs humanas infectadas com amastigotas de L. amazonensis foram expostas à hipóxia de 6% de oxigênio. A avaliação fenotípica das culturas indicou que a hipóxia, apesar de não afetar a viabilidade das células, reduziu a expressão dos marcadores de superfície celular CD80, CD86 e CD1a. A hipóxia não afetou a entrada do parasita nas DCs, mas modulou a atividade funcional das DCs, com diminuição da infecção em cerca de 30%. Na presença de ativadores como LPS e INF-g, as DCs foram capazes de reduzir a porcentagem de infecção em normóxia, sendo que a hipóxia não potencializou este efeito estimulador. No entanto, essas mesmas culturas ativadas e infectadas em hipóxia produziram menos IL-12 que as culturas controle em normóxia. O efeito da hipóxia sobre drogas leishmanicidas Anfotericina B, Glucantime e Miltefosine foram também avaliados. As curvas dose-resposta e análise das IC50s de Anfotericina B e Glucantime sugeriram que a hipóxia anulou ou diminuiu a ação das drogas nas culturas de DCs infectadas durante 48 horas de tratamento, quando comparados ao controle em normóxia. Já o Miltefosine agiu de forma semelhante tanto em normóxia como em hipóxia. Por fim, analisamos o processo de interação Leishmania-DC utilizando amastigotas isolados de lesões de camundongos C3H/nude (os quais não apresentam anticorpos na superfície). A porcentagem de infecção das DCs com amastigotas ¿nude¿ foi de 36%. A opsonização destes parasitas com soro humano elevou a porcentagem de infecção em torno de 40%. A inativação e a depleção de anticorpos destes soros diminuiu marcadamente a porcentagem de infecção proporcionada pela opsonização, indicando o envolvimento de receptores para Fc (FcR) e para Complemento (CRs) na fagocitose dos parasitas. A infecção das DCs também foi inibida em 50% após tratamento dos amastigotas com heparina. Nós não relacionamos os receptores de manose fucose com a entrada do amastigotas nas DCs. Nossos dados sugerem que o processo de infecção das DCs envolve a participação de pelo menos três interações receptor/ligante (FcR/anticorpos, CRs/complemento e proteoglicanas/proteína ¿ligadora¿ de heparina)

Abstract: Dendritic cells (DCs) are antigen-presenting cells involved in the initiation of primary immune response. Human DC were obtained from peripheral blood monocytes after culturing with GM-CSF and IL-4. Leishmania parasites are intracellular protozoan that replicate in Mononuclear Phagocytic System cells, mainly macrophages and DCs. Leishmania amazonensis, a species used in our studies is associated with cutaneous infection that can become chronical lesions with a inflammatory process and small regions of hypoxia. In this work we evaluated the role of hypoxia in a in vitro model of intracellular infection, leishmaniasis. Human DCs infection with infected by L. amazonensis amastigotes were performed under normoxic (21% O2) and hypoxic (6% O2) conditions. The phenotypic analysis of DC cultured under hypoxic condition showed a reduced expression of CD80, CD86 and CD1a compared with normoxic control. In these cell cultures, viability was not affected. Hypoxia did not affect the amastigote entrance into DCs although it modulated their functional activity reducing 30% the percentage of infected DCs. Furthermore, hypoxia did not act synergistically with IFN-g plus LPS in DCs to induce killing of parasites. DCs activated and infected with amastigotes under hypoxic condition produced low levels of IL-12 compared with normoxic control. Moreover, in the abscence of stimulation, infected DCs did not produce IL-12. We also evaluated the leishmanicidal activity of Amphotericin-B, Glucantime and Miltefosine under normoxic and hypoxic conditions during 48 h. Under hypoxic condition, Amphotericin-B and Glucantime were less efective in L. amazonensis infected DCs. None effect of hypoxia was observed in Miltefosine was observed against L. amazonensis infected DC. Finally, we investigated in vitro mechanisms of entry into human DCs of L. amazonensis amastigotes isolated from lesions in nude mice (Am nude). The DC infection rate with Am nude was approximately 36%, while opsonization of Am nude with normal human serum and infected human serum increased the DC infection rates to 60% and 62%, respectively. Heat inactivation and depletion of antibodies in sera brought the DC infection rate down to 40%. The DC infection rate was inhibited after pre-treatment of Am nude with heparin. We were unable to implicate mannose-fucose receptors in the uptake of Am nude by DCs. Our data suggest that the ability of L. amazonensis amastigotes to infect human DCs involves the participation of at least three multiple receptor-ligand interactions, antibodies/FcR, complement components/CR and proteoglycans/heparin-binding protein
Subject: Leishmania amazonensis
Células dendríticas
Hipóxia celular
Language: Português
Editor: [s.n.]
Citation: BOSETTO, Maira Cegatti. Avaliação dos efeitos de microambiente hipoxico em celulas dendriticas humanas infectadas com Leishmania amazonensis. 2007. 162p. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: <http://www.repositorio.unicamp.br/handle/REPOSIP/317274>. Acesso em: 8 ago. 2018.
Date Issue: 2007
Appears in Collections:IB - Tese e Dissertação

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