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Type: TESE
Degree Level: Doutorado
Title: Analise da influencia das fontes de carbono na patogenicidade do Moniliophthora perniciosa pathogenicity em Theobroma cacao
Title Alternative: Analisys of carbon sources influence on Moniliophthora perniciosa pathogenicity in Theobroma cacao
Author: Alvim, Fatima Cerqueira
Advisor: Vincentz, Michel Georges Albert, 1958-
Abstract: Resumo: O fungo basidiomiceto hemibiotrófico Moniliophthora perniciosa, agente causal da doença vassoura-de-bruxa (VB) em Theobroma cacao, é o principal patógeno da lavoura cacaueira nas Américas e no Caribe. O presente trabalho apresentou como objetivo primordial identificar proteínas relacionadas com a patogenicidade deste fungo. No primeiro capítulo desta tese foi demonstrado o efeito de diferentes fontes de carbono sobre a morfologia e fisiologia do M, perniciosa. O fungo foi crescido em fontes de carbono fermentáveis e/ou não-fermentáveís. Foram observadas diferenças significativas na morfologia do micélio que se correlacionaram com a fonte de carbono utilizada. Foram observadas também diferenças qualitativas e quantitativas marcantes para as proteínas secretadas (secretoma) pelo micélio. O ensaio biológico efetuado em folhas de Nicotiana tabacum revelou que a capacidade do secretoma em induzir necrose nos tecidos vegetais também diferia em função da fonte de carbono utilizada pelo fungo durante o seu crescimento. O glicerol, como fonte única de carbono, foi identificado como o composto que mais induziu a atividade necrótica do secretoma do patógeno. O nível do chaperone molecular BiP (Binding Protein) em meristema de cacau aumentou em resposta à infiltração do secretoma de M. perniciosa, indicando uma resposta fisiológica do hospedeiro às proteínas secretadas in vitro pelo patógeno. Foi sugerido então que o metabolismo energético de M. perniciosa, dependendo das fontes de carbono aplicadas, resulta em alterações fisiológicas na expressão e secreção de proteínas e que esses efeitos atuam, não apenas afetando o crescimento do fungo, mas também, na capacidade de expressar proteínas de patogenicidade. No segundo capítulo investigamos mais detalhadamente as modificações induzidas por glicerol em M. perniciosa. Inicialmente demonstramos que glicerol induz a secreção de proteínas relacionadas com indução de morte celular especificamente no M. perniciosa dicariótico, tipo celular característico da fase necrotrófica do patógeno. O secretoma induzido por glicerol foi o único capaz de induzir necrose em meristemas de cacau do genótipo resistente a M. perniciosa. Simultaneamente, o glicerol induziu alterações na composição/estrutura da parede celular do micélio tomando-a mais resistente a agentes indutores de estresse em parede celular, como o SDS e vermelho congo. Adicionalmente, o micélio apresentou maior nível de transcritos de catalases, indicando uma maior resistência a estresse oxidativo. Análises em géis bi-dimensionais e fracionamento das amostras em HPLC de alta capacidade, ligados a espectrometria de massas, resultaram na identificação de proteínas secretadas que acumularam especificamente em resposta ao glicerol. Proteases e lipases, enzimas hidrolíticas relacionadas com a patogenicidade em outros fungos hemibiotrdfícos, também apresentaram aumento de atividade em resposta a glicerol. Essas alterações correlacionaram com um aumento no nível de transcritos do gene Rholp-gef, um elemento chave da rota RHOlp GTPase, a qual sabidamente está relacionada a virulência de fungos fitopatogênicos. Análises conduzidas com isolados de M. perniciosa, que apresentaram diferentes graus de patogenicidade em ensaios conduzidos em casa de vegetação, demonstraram que a sensibilidade a glicerol é maior nos genótipos mais patogênicos. Esse estudo ressalta a importância do glicerol como uma molécula chave na interação cacau: M. perniciosa. tipo celular característico da fase necrotrófica do patógeno. O secretoma induzido por glicerol foi o único capaz de induzir necrose em meristemas de cacau do genótipo resistente aM perniciosa. Simultaneamente, o glicerol induziu alterações na composição/estrutura da parede celular do micélio tomando-a mais resistente a agentes indutores de estresse em parede celular, como o SDS e vermelho congo. Adicionalmente, o micélio apresentou maior nível de transcritos de catalases, indicando uma maior resistência a estresse oxidativo. Análises em géis bi-dimensionais e fracionamento das amostras em HPLC de alta capacidade, ligados a espectrometria de massas, resultaram na identificação de proteínas secretadas que acumularam especificamente em resposta ao glicerol. Proteases e lipases, enzimas hidrolíticas relacionadas com a patogenicidade em outros fungos hemibiotróficos, também apresentaram aumento de atividade em resposta a glicerol. Essas alterações correlacionaram com um aumento no nível de transcritos do gene Rholp-gef, um elemento chave da rota RHOlp GTPase, a qual sabidamente está relacionada a virulência de fungos fltopatogênicos. Análises conduzidas com isolados de M. perniciosa, que apresentaram diferentes graus de patogenicidade em ensaios conduzidos em casa de vegetação, demonstraram que a sensibilidade a glicerol é maior nos genótipos mais patogênicos. Esse estudo ressalta a importância do glicerol como uma molécula chave na interação cacau: M. perniciosa

Abstract: The basidiomycete hemibiotrophic fungus Moniliophthora perniciosa, the causal agent of witches' broom disease in Theobroma cacao, is the major cacao disease pathogen present in the Americas and the Caribbean. A compatible interaction of this fungus with its host comprehends a series of concerted biochemical and molecular events. In the first chapter of the thesis, we performed analyses where quantitative and qualitative relationships were found between secreted proteins and their activity, and the hyphal morphology of Moniliophthora perniciosa. This fungus was grown on fermentable and non-fermentable carbon sources; significant differences in mycelial morphology were observed and correlated with the carbon source. A biological assay performed with Nicotiana tabacum leaves revealed that the necrosis-related activity of extracellular fungal proteins also differed with carbon source. There were clear differences in the type and quantity of the secreted proteins. In addition, the expression of the cacao molecular chaperone BiP (HSP 70) increased after treatment with secreted proteins, suggesting a physiological response to the fungus secretome. We suggest that the carbon source-dependent energy metabolism of M. perniciosa results in physiological alterations in protein expression and secretion; these may affect not only M. perniciosa growth, but also its ability to express pathogenicity proteins. In the second chapter, we showed that glycerol efficiently triggers the production of secreted pathogenicity proteins by M. perniciosa, as revealed by the increased ability of the secreted proteins (secretome) in promoting cell death on Nicotiana benthamiana cell suspensions, N. tabacum leaves and meristems of a resistant cacao genotype, when compared to other carbon sources such as glucose. Simultaneously, glycerol induces cell wall modifications turning hyphae more resistant to inducers of cell wall stress and increasing the resistance of the fungus to oxidative stress. These modifications correlated with the up-regulation of RhoJp-gef, a key element of the RHOlp GTPase pathway that is known to be related to fungal virulence in plants. Two-dimensional gel electrophoresis and high throughput HPLC coupled with mass spectrometry resulted in the identification of secreted proteins that specifically accumulated in response to glycerol. This study highlights the importance of glycerol as a key molecule modulating the fungus-induced pathogenicity
Subject: Moniliophthora perniciosa
Proteínas
Morte celular
Patogenicidade
Language: Português
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2009
Appears in Collections:IB - Tese e Dissertação

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