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Type: TESE DIGITAL
Title: Modulação in vitro da barreira epitelial tubular renal mediada pelas junções de oclusão : efeito da exposição à glicose e ácido palmítico
Title Alternative: Modulation of the tight junction-mediated renal tubular epithelial cell barrier in vitro : effect of exposure to glucose and palmitic acid
Author: Mongelli Sabino, Bárbara Matiello, 1989-
Advisor: Collares-Buzato, Carla Beatriz, 1965-
Buzato, Carla Beatriz Collares, 1965-
Abstract: Resumo: A nefropatia diabética (ND) é uma doença que acomete 20 a 40% dos pacientes diabéticos, sendo que a maioria dos casos está relacionada à diabetes melito tipo 2 (DMT2). A patogênese da ND envolve hipertrofia glomerular, proteinúria, redução na taxa de filtração glomerular e fibrose túbulo-intersticial. Acredita-se que essas alterações estejam associadas, pelo menos em parte, ao quadro de hiperglicemia e dislipidemia (com aumento dos níveis plasmáticos de ácidos graxos) observado na DMT2. Estudos sobre alterações no epitélio dos túbulos renais na ND são escassos, e ainda, não há trabalhos investigando possível repercussão da barreira epitelial paracelular dos túbulos renais, mediada pelas junções de oclusão, nessa condição. O objetivo geral dessa Dissertação de Mestrado foi investigar os efeitos "in vitro" de concentrações elevadas de glicose (180 e 360 mg/dL) e de ácido palmítico (200 e 400 ?M) sobre a função de barreira epitelial mediada pelas junções de oclusão em linhagem estabelecida de células epiteliais tubulares renais (células MDCK). Para tal, foram analisados parâmetros funcionais (Resistência elétrica transepitelial - Rt e Fluxo transepitelial - Ft) e bioquímicos/morfológicos (imunofluorescência e Western Blotting). Observou-se que, após 72h de exposição à concentração de 180 mg/dL de glicose, as células apresentaram redução significativa na Rt, enquanto a concentração de 360 mg/dL de glicose induziu uma tendência, não estatisticamente significativa, de redução dessa medida. Não foram observadas alterações significativas no parâmetro de Ft, tendo sido detectada apenas uma pequena tendência de aumento do fluxo em células tratadas, em relação ao controle. Como revelada por imunocitoquímica, a concentração de 180 mg/dL induziu redução no conteúdo juncional das proteínas da JO, a saber as claudinas-1,-3 e ZO-1, associada com aumento significativo de claudina-2. A exposição à concentração de 360 mg/dL similarmente resultou em redução significativa no conteúdo juncional de claudinas-1,-3, ocludina e ZO-1 mas sem modificação de claudina 2. Entretanto, as células expostas a ambas as concentrações de glicose não apresentaram diferença quanto ao nível proteico total dessas proteínas juncionais em relação às do grupo controle, como avaliado por Western Blotting em homogenizados de células. As monocamadas expostas às concentrações de 200 e 400 ?M de ácido palmítico não apresentaram alterações significativas da Rt. Entretanto, células expostas à concentração de 400 ?M exibiram uma tendência de aumento no Ft (P=0,06). As concentrações elevadas de ácido palmítico induziram redução significativa na localização juncional de claudinas-1,-3 ocludina e ZO-1, enquanto o conteúdo juncional de claudina-2 só apresentou redução em células expostas à concentração de 200 ?M. Não houve alterações no nível proteico total dessas proteínas juncionais nas células expostas às duas concentrações de ácido palmítico. Em conclusão, a glicose e o ácido palmítico, em concentrações compatíveis com os níveis séricos verificados em pacientes diabéticos, podem induzir alterações estruturais na barreira epitelial mediada pelas junções de oclusão em células tubulares renais in vitro; tal efeito pode ter repercussão no desenvolvimento da ND

Abstract: Diabetic nephropathy (DN) is a disease that affects 20 to 40% of diabetic patients, where the majority of the cases are associated with the type 2 Diabetes Mellitus (T2DM). The pathogenesis of DN involves glomerular hypertrophy, proteinuria, impaired glomerular filtration barrier and tubulointerstitial fibrosis. These alterations are partly related to the occurrence of hyperglycemia and dyslipidemia (including increased blood level of free fatty acid) observed in diabetic state. There are few studies on the role of the renal tubular epithelial barrier mediated by tight junction (TJ) in the development of DN. The general objective of this Master's Thesis was to investigate the in vitro effects of elevated concentrations of glucose (180 and 360 mg/dL) and palmitic acid (200 and 400 ?M) in the structure and function of the TJ-mediated epithelial barrier in a renal tubular epithelial cells, the MDCK cell line. The integrity of the epithelial barrier function was assessed by functional (transepithelial electrical resistance ¿ Rt, and transepithelial flux of paracellular marker - Ft) and biochemical/morphological means (immunofluorescence and Western blotting for TJ proteins). We observed that, after 72h of exposure to glucose concentration of 180 mg/dL, MDCK monolayers displayed significant reduction of Rt, while the glucose concentration of 360 mg/dL induced a tendency of decrease in this parameter associated with a tendency of increase in Ft of phenol red. As revealed by immunocytochemistry, both concentrations of glucose (180 and 360 mg/dL) induced significant reduction in the junctional content of proteins such as claudins-1, and -3 and ZO-1. Meanwhile, the claudin-2 content increased only in MDCK cells exposed to 180 mg/mL of glucose in comparison with controls. However, as analyzed by immunoblotting of cell homogenates, no differences in total cell content of TJ-associated proteins were observed among the experimental groups. Monolayers exposed to palmitic acid at concentrations of 200 or 400 ?M showed no significant changes in Rt; however MDCK cells exposed to 400 ?M exhibited a subtle increase of Ft of phenol red (P=0,06). Both concentrations of palmitic acid induced significant decrease in junctional content of claudins1,-3, occludin and ZO-1 in relation to control cells. However, only MDCK cells exposed to 200 ?M presented significant reduction of the junctional content of claudin-2. No significant alterations to the total cell content of the junctional proteins studied were observed after high palmitic acid exposure as compared to control MDCK cells. In conclusion, exposure to high glucose and palmitic acid concentrations induces structural disruption of the TJ-mediated renal tubular epithelial barrier. These findings may have relevance for the pathogenesis of DN
Subject: Diabetes Mellitus
Nefropatias diabeticas
Claudinas
Células epiteliais
In Vitro
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2015
Appears in Collections:IB - Tese e Dissertação

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