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Type: TESE
Title: Caracterização bioquimica e molecular do componente transcriptase reversa da telomerase de Leishmania spp
Title Alternative: Biochemical and molecular characterization of the Leishmania spp. telomerase reverse transcriptase component
Author: Giardini, Miriam Aparecida
Advisor: Cano, Maria Isabel Nogueira
Abstract: Resumo: Telômeros são complexos DNA-proteínas que protegem os cromossomos eucarióticos da degradação, garantindo estabilidade genômica. As seqüências teloméricas são ricas em G e apresentam uma protrusão 3¿ simples-fita que se estende em direção ao terminal cromossômico. Em Leishmania, os telômeros são compostos pela seqüência repetida 5¿-TTAGGG-3¿ e são replicados pela telomerase, a principal responsável pela manutenção dos terminais cromossômicos em eucariotos. Além de replicar os telômeros, o complexo holoenzimático da telomerase, composto pela transcriptase reversa da telomerase (TERT), pelo RNA da telomerase (TER) e por proteínas associadas, também atua como parte de um complexo de ordem maior que protege os terminais teloméricos. O entendimento do mecanismo de regulação da manutenção telomérica será de grande valor científico e poderá levar ao descobrimento de algum alvo potencial para o desenvolvimento de novas drogas anti-leishmania. Com esse objetivo, identificamos, clonamos e caracterizamos o gene que codifica o componente TERT em Leishmania spp.. O alinhamento múltiplo das seqüências através do programa ClustalW demonstrou que as telomerases de Leishmania apresentam muito mais homologia entre si do que com as proteínas de outros kinetoplastídeos e eucariotos. Experimentos de caracterização indicaram que a seqüência putativa do gene da telomerase de Leishmania localiza-se provavelmente em cópia única nos maiores cromossomos. Um único transcrito de RNA mensageiro foi encontrado nos promastigotas. Análises filogenéticas sugeriram que a telomerase de Leishmania pode representar uma ligação entre os mais antigos e os mais novos ramos das telomerases. Além disso, proteínas recombinantes foram expressas em sistema bacteriano, tornando possível a produção de anticorpos policlonais em coelhos. Experimentos de ¿Western blotting¿ e imunoprecipitação de cromatina indicaram que o anticorpo foi capaz de reconhecer a proteína nativa e que a telomerase de L. amazonensis interage in vivo com a seqüência telomérica rica em G. A atividade de telomerase de L. amazonensis foi purificada utilizando-se uma combinação de colunas cromatográficas. Testou-se a atividade enzimática em cada passo da purificação utilizando-se o ensaio ¿Two-tube TRAP¿. Os resultados mostraram que a atividade enzimática é encontrada nas frações purificadas pelas cromatografias de troca iônica, de afinidade por Heparina e de gel filtração. A atividade foi altamente enriquecida após a purificação por afinidade utilizando um oligonucleotídeo de DNA telomérico rico em G. Quando foi utilizado um oligorribonucleotídeo 2¿O-metil complementar à putativa seqüência molde do TER de Leishmania como ligante na cromatografia de afinidade, pouca ou nenhuma atividade enzimática foi eluída da resina, sugerindo que a interação entre a telomerase de L. amazonensis e este oligorribonucleotídeo é tão forte que não permite sua dissociação nas condições de eluição gentis necessárias para manter a atividade enzimática. Formas procíclicas de Trypanosoma brucei foram utilizadas para a construção do sistema ¿PTP-tagging¿, no intuito de futuramente purificar o complexo holoenzimático da telomerase. Em paralelo, ensaios de ¿primer extension¿ foram padronizados e identificou-se uma seqüência candidata ao gene do RNA da telomerase de T. brucei. Também foi identificada e clonada em L. amazonensis, uma seqüência homóloga à PinX1 humana, descrita como uma proteína que interage diretamente com a TERT humana e considerada um inibidor natural da atividade de telomerase

Abstract: Telomeres are protein-DNA complexes that protect linear chromosomes from degradation, providing genomic stability. The telomeric sequences are G-rich and contain a 3¿ single-stranded region that protrudes toward the chromosome end. In Leishmania, the telomeric DNA is composed by the conserved 5¿-TTAGGG-3¿ repeated sequence and it is replicated by telomerase. Telomerase is responsible for maintaining chromosome ends in most eucaryotes by adding new telomeric sequences to the G-rich strand. Besides replicating telomeres, the telomerase holoenzyme complex, composed by the reverse transcriptase component (TERT), the telomerase RNA (TER) and associated proteins, also works as part of the higher order complex that protects telomeric ends. Understanding the regulation of the telomeric maintainance mechanism may allow the discovery of potential targets to the development of new antileishmania drugs. Therefore, we identified, cloned and characterized the TERT gene in Leishmania spp.. A ClustalW multiple-sequence alignment demonstrated that the Leishmania telomerases show greater homology with each other than with the proteins of other kinetoplastids and eukaryotes. Characterization experiments indicated that the putative Leishmania TERT gene was probably located in single copy at the largest chromosomes. A single messenger RNA transcript was found in promastigotes. Phylogenetic analysis suggested that Leishmania telomerase might represent a liaison between the oldest and the newest branches of telomerases. Besides that, recombinant proteins were expressed in bacterial system, allowing production of anti-LaTERT polyclonal serum in rabbits. Western blotting and chromatin immunoprecipitation assays indicated that the anti-LaTERT serum was able to recognize a native protein in nuclear and total extracts of the parasite and that L. amazonensis telomerase interacts in vivo with the G-richtelomeric sequence. We have also purified the L. amazonensis telomerase activity in order to better understand its biochemical features. Protein extracts of L. amazonensis containing telomerase activity were purified using combined chromatographic columns. Enzyme activity was tested in each purification step using the ¿Two-tube TRAP¿ assay. The results showed that enzyme activity is found in fractions purified by ion exchange (DEAE), Heparin affinity and gel filtration chromatographic methods. The activity was greatly enriched after affinity purification using a G rich telomeric DNA oligonucleotide as the ligand. When a 2¿O-methyl oligoribonucleotide complementary to the putative L. amazonensis TER template was used as a ligand in the affinity purification, little or no enzyme activity was eluted from resin, suggesting that the interaction between L. amazonensis telomerase and this oligoribonucleotide is too strong that disables its dissociation under the gentle elution conditions necessary to maintain enzyme activity. In order to identify the telomerase holoenzyme components, procyclic forms of Trypanosoma brucei were used to construct the PTP-tagging system. ¿Primer extension¿ reactions were also done in order to isolate and sequence an RNA candidate for the telomerase RNA gene in T. brucei. In addition, we have cloned a L. amazonensis homologue of the human PinX1 protein, previously known as a hTERT-interacting factor and as a potent telomerase inhibitor
Subject: Telômeros
Telomerase
Transcriptase reversa da Telomerase (TERT)
Leishmania
Language: Português
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2007
Appears in Collections:IB - Dissertação e Tese

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