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Type: TESE
Degree Level: Doutorado
Title: Analise comparativa da expressão de genes de Xylella fastidiosa associados a patogenicidade e formação de biofilme
Author: Souza, Alessandra Alves de
Advisor: Machado, Marcos Antonio
Abstract: Resumo: O presente trabalho tem como objetivo detectar e estudar a expressão de genes possivelmente envolvidos com patogenicidade da estirpe 9a5c de X. fastidiosa. Para desenvolvimento do trabalho foram utilizadas bactérias imediatamente após o isolamento da planta sintomática, denominado aqui isolamento primário (IP) e bactérias após 46 repicagens (SR) sucessivas em meio de cultura. Uma possível perda de virulência da X. fastidiosa submetida às condições de SR foi verificada inoculando-se plantas de laranja doce (Citrus sinensis) e vinca (Cataranthus roseus) com as bactérias obtidas nestas condições. Através do uso de PCR quantitativo em tempo real, foi verificado que a colonização das células originadas de SR foi menos eficiente em ambos hospedeiros. A tecnologia de DNA 'microarray' foi utilizada para investigar as mudanças da expressão gênica associadas com a condição IP. Verificou-se que muitos dos genes diferencialmente expressos codificam para proteínas hipotéticas. Genes potencialmente envolvidos com patogenicidade, virulência e adaptação foram induzidos apenas na condição IP. Três destes genes (fimA, hsf e uspA1) foram associados com adesão na superfície do hospedeiro e quatro (msrA, acrA, cvaC e xpsE) com a capacidade de adaptação do patógeno no ambiente do hospedeiro. A indução destes genes na condição IP foi confirmada por RT-PCR tanto na condição in vitro quanto na condição in planta 15 dias após inoculação, período este que corresponde ao início da colonização. Contudo, 90 dias após inoculação, período de colonização mais avançada com o surgimento dos primeiros sintomas, o nível de expressão dos genes de adesão foi similar em ambas condições de crescimento. Entretanto, uma maior expressão foi observada na condição IP para os genes envolvidos com adaptação no ambiente do hospedeiro. Estes resultados sugerem que a adesão é importante para o início da formação do biofilme. Por outro lado, os genes relacionados com adaptação são essenciais para manutenção do biofilme in planta. Também, a expressão destes genes durante a formação de biofilme in vitro em X. fastidiosa foi avaliada por RT-PCR semi-quantitativo após 3, 5, 10, 20 e 30 dias de crescimento em superfície de vidro na interface líquido-ar. A expressão dos genes na condição in vitro foi similar à condição in planta, onde os genes de adesão tiveram uma maior indução nas etapas inicias de formação de biofilme. Estes resultados indicam que estes genes podem estar envolvidos com a adesão em diferentes superfícies. Entretanto, apenas alguns genes relacionados à adaptação (xpsE, acrA) se comportaram de forma similar ao observado in planta, ou seja, com maior indução na etapa de biofilme maduro. Isto pode ser resultado dos diferentes ambientes experimentais utilizados, uma vez que, a expressão destes genes pode ser regulada de acordo com o ambiente pela qual a bactéria é exposta. Análises de microscopia ótica em diferentes fases do biofilme formado em lâminas de vidro revelaram que a formação de biofilme em X. fastidiosa apresenta pelo menos cinco fases distintas, sendo aos 20 dias a fase de maior densidade celular. Vários são os estudos que visam detectar os genes expressos em diferentes fases e ambientes da formação de biofilme, principalmente em bactérias que causam doenças em humanos, uma vez que, a formação do biofilme tem sido atribuída como a causa de sérias doenças. Contudo, há poucas informações em relação à expressão de genes envolvidos na formação de biofilme em patógenos de plantas. Por este motivo, e como a formação de biofilme indica ser o mecanismo primário de patogenicidade de X. fastidiosa, foi utilizada a tecnologia do DNA 'microarray' para avaliar os genes expressos na fase de biofilme maduro comparado ao crescimento planctônico. Um total de 202 genes (9,18%) foram significativamente induzidos, enquanto que 32 genes (1,45%) foram reprimidos na condição de biofilme. A maioria dos genes diferencialmente expressos codifica para proteínas ainda hipotéticas. Na condição de crescimento em biofilme foi verificado um aumento da expressão de genes 'housekeeping¿ que codificam funções metabólicas. Também foi detectado um grande número de genes do mega plasmídio pXF51 sendo diferencialmente expresso, o que poderia provavelmente estar associado com transferência horizontal de genes em X. fastidiosa em biofilme. Em relação a categoria de patogenicidade, a maioria dos genes expressos na condição de biofilme foram associados com produção e detoxificação de toxinas e adaptação para crescimento em condições atípicas. A expressão destes genes associados com adaptação pode conferir características competitivas à X. fastidiosa no habitat a ser colonizado, dando uma clara indicação da importância destes fatores no estabelecimento do biofilme. Tais afirmações demonstram que a propriedade fisiológica do biofilme de X. fastidiosa é similar ao observado em bactérias patogênicas em humanos, indicando que a formação de biofilme como mecanismo de patogenicidade de bactérias de diferentes hospedeiros apresentam características comuns

Abstract: The main goal of this study is to survey the expression of genes possibly involved in the pathogenicity of strain 9a5c of X. fastidiosa. Freshly-isolated bacteria from symptomatic plants (first passage condition or FP) as well as bacteria obtained after 46 transfers to axenic culture (several passage condition or SP) were utilized in this work. A possible lost of virulence of the X. fastidiosa in the SP condition was verified after inoculation into sweet orange and periwinkle plants. Using real-time quantitative PCR, we verified that the colonization of SP cells was less efficient in both hosts. The DNA microarray technology was used to investigate the global changes in gene expression associated with the pathogenic FP condition. Most of the differentially expressed genes encode hypothetical proteins. Genes potentially involved with pathogenicity, virulence and adaptation were induced in the FP condition. Three of these genes (fimA, hsf and uspA1) are associated with adhesion to the host surfaces and four (msrA, acrA, cvaC e xpsE) with adaptation in the host environment. The induction of these genes in the FP condition was confirmed by RT-PCR both in vitro and in planta 15 days after inoculation, period in which the initial colonization of the vessels was taking place. Ninety days after inoculation, when the colonization had reached to more advanced stages and the first symptoms were developed, the expression levels of the adhesion genes were similar although a higher expression was observed for genes related to adaptation in the pathogenic condition. These results suggest that the adhesion is important at the beginning of the biofilm formation, whereas the genes related to adaptation are essential for the maintenance of this biofilm in planta. We also evaluated the expression of these genes in vitro during biofilm formation by semiquantitative RT-PCR after 3, 5, 10, 20 and 30 days of growth at the medium-air interface in a glass flask. The gene expression observed under in vitro condition was similar to that observed in planta for the adhesion genes whose expression occurred mainly at the initial step of biofilm formation. These results indicate that these genes can be involved in adhesion to different attachment surfaces. In relation to the adaptation-related genes, xpsE and acrA showed and expression pattern similar to that observed in planta, with over-expression in the mature biofilm. On the other hand, the expression of cvaC and msrA did not show the same pattern as found in the in planta. These genes showed little differences in relation to the stages of biofilm development. This difference could have resulted from the different experimental designs utilized since the genetic reprogramming of gene expression of the bacterial biofilm depends on the changes in multiple environmental conditions to which the bacterium is exposed. Light transmission microscopy analysis of different phases of the biofilm formed in glass covers revealed that the X. fastidiosa biofilm development presented five distinct stages. At the 20th day, the biofilm showed high cell density. A considerable increase in the gene expression number studies involving biofilm formation has been observed, mainly for bacteria causing human diseases, since the biofilm formation has been associated with serious diseases. However, limited information is available concerning gene expression involved in biofilm formation in plant-pathogen interactions. For this reason and because biofilm formation seems to be the main pathogenicity mechanism in X. fastidiosa, we utilized the microarray technology to access changes in gene expression in mature biofilm cells when compared with planktonic cells. A total of 202 genes (9.18%) were significantly up-regulated, while 32 genes (1.45%) were downregulated in the mature biofilm. The majority of the differentially expressed genes encodes hypothetical proteins. Under the biofilm condition we observed an increase in the expression of some housekeeping genes responsible for metabolic functions. We also found a large number of genes from the pXF51 plasmid being differentially expressed. This could possibly be associated with lateral gene transfer in the X. fastidiosa biofilm. Moreover most of the pathogenicity-related genes over-expressed in the biofilm condition were associated with toxin production, detoxification and adaptation to atypical conditions. The expression of genes associated with adaptation and competitiveness in the habitat to be colonized gives a clear indication of the importance of such factors in the established biofilm of X. fastidiosa. This demonstrates that the physiological properties of this biofilm are similar to the ones observed in human pathogens, indicating that the pathogenicity mechanisms of bacteria of different host may show common characteristics
Subject: Bactérias
DNA
Genomas
Language: Português
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2004
Appears in Collections:IB - Tese e Dissertação

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