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Type: TESE DIGITAL
Degree Level: Doutorado
Title: Análise do papel do microtranscritoma na tolerância à seca em cana-de-açúcar = Analysis of sugarcane microtranscritome in drought tolerance
Title Alternative: Analysis of sugarcane microtranscritome in drought tolerance
Author: Dias, Lara Isys, 1982-
Advisor: Menossi, Marcelo, 1968-
Abstract: Resumo: A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é a cultura mais promissora para a obtenção de energia renovável, tendo sua produção movida pelo setor sucroenergético. O Brasil é o maior produtor mundial e os cultivares atualmente utilizados são híbridos interespecíficos aneuplóides, resultado do melhoramento genético clássico. As espécies selvagens que deram origem a esses cultivares, Saccharum officinarum e Saccharum spontaneum, possuem características importantes para a produção como alto teor de sacarose e resistência à doenças e estresse abióticos, respectivamente. Contudo, as perdas de produtividade são frequentes nas regiões produtoras. A regulação gênica mediada por microRNAs pode estar relacionada a mecanismos de tolerância a estresses abióticos. Os microRNAs são sequências de RNA de 19-24 nucleotídeos. Esses pequenos RNAs (sRNAs) atuam no silenciamento gênico através da clivagem ou repressão da tradução de genes alvos, por similaridade quase perfeita de suas sequências. Neste trabalho foi realizada a análise do microtranscritoma de plantas de cana-de-açúcar com 11 meses, cultivadas em campo sob regimes de irrigação (controle) ou sequeiro (estressado). Amostras de sRNAs folhas de quatro cultivares foram sequenciadas (RB867515, RB855536, RB92579 e RB72454). As análises fisiológicas de trocas gasosas, como condutância estomática, fotossíntese e transpiração, e de desenvolvimento das plantas mostraram que os quatro cultivares sofreram os efeitos da seca. A análise do sequenciamento permitiu a identificação de um total de 29 miRNAs, pertencentes a 19 famílias. Dentre esses, 27 microRNAs, pertencentes a 17 famílias, foram diferencialmente expressos pela seca nos quatro cultivares de Saccharum spp. analisados. A predição de alvos para o miRNAs diferencialmente expressos levou à identificação dos genes relacionados à biogênese dos próprios microRNAs, ao desenvolvimento das plantas e de genes envolvidos em respostas a estresses abióticos, em particular à seca. Os microRNAs ssp-miR164, ssp-miR171-seq 2, ssp-miR393 e ssp-miR528 foram reprimidos pela seca, tendo como alvos preditos genes que codificam para proteínas com domínio NAC, fator de transcrição tipo SCARECROW (SCL), proteína de transporte relacionada à auxina (TIR1) e a subunidade ?EI da enzima piruvato desidrogenase, respectivamente. Experimentos de PCR em tempo real confirmaram as correlações de expressão esperados para a maioria os miRNAs e seus respectivos genes alvo. As construções de silenciamento gênico para os microRNAs ssp-miR164, ssp-miR171-seq 2, ssp-miR393 e ssp-miR528 foram obtidas a com a técnica de microRNA artificial (amiRNA). Os experimentos de transformação gênica em calos embriogênicos de Setaria viridis via Agrobacterium tumefaciens evidenciaram a necessidade de uma real padronização no protocolo desse procedimento, devido, principalmente, à dificuldade na eliminação das agrobactérias após infecção dos calos. A análise do microtranscritoma permitiu a identificação dos microRNAs diferencialmente expressos sob seca, bem como a predição das principais rotas reguladas por esses sRNAs. Os alvos de quatro microRNAs que foram reprimidos pela seca nessas plantas estão envolvidos com processos potencialmente associados à características agrícolas importantes de resposta à seca. Tais genes devem ser explorados funcionalmente em plantas modelo com protocolos adequados, bem como em plantas de cana-de-açúcar. As informações geradas neste trabalho aumentam o conhecimento dos mecanismos moleculares das plantas do complexo Saccharum em resposta ao estresse hídrico e auxiliam futuros estudos na busca por cultivares que apresentem maior nível de tolerância à seca

Abstract: Sugarcane (Saccharum spp.) is the most promising crop of renewable energy, which production is driven by alcohol and sugar industry. Brazil is the world leading producer, and as result of classical genetic improvement cultivars used are aneuploid interspecific hybrids. The wild parents, Saccharum officinarum e Saccharum spontaneum, have important features as high sucrose content and diseases and abiotic stresses resistance, respectively. However, yield losses are frequent in producing regions. Genic regulation performed by microRNAs might be related to abiotic stresses tolerance. MicroRNAs comprise RNA sequences of 19-24 nt. These small RNAs (sRNAs) act in gene silencing by cleavage or translation repression of target genes, by near perfect base pairing. In this work, the microtranscriptome of 11 months old field grown sugarcane plants were evaluated, plants were cultivated under irrigation (control) or dry land (stressed). Samples of sRNAs extracted from leaves of four Brazilian cultivars were sequenced (RB867515, RB855536, RB92579 e RB72454). Physiological analysis of gas exchanges, like stomatal conductance, photosynthesis and transpiration, and plant development measures showed that drought affected the four cultivars. Sequencing analysis allowed the identification of 29 miRNAs, from 19 families. From these, 27 microRNAs, from 17 families, were differentially expressed by drought in the four Saccharum spp. cultivars analyzed. From target prediction for the differentially expressed microRNAs, genes related to miRNAs biogenesis, plant development and stress responsive genes, in particular drought, were identified. Ssp-miR164, ssp-miR171-seq 2, ssp-miR393 and ssp-miR528 were down regulated by drought, and predicted target genes for these miRNAs are NAC-domain protein, SCARECROW-like transcription factor (SCL), auxin related transport inhibitor response protein 1 (TIR1), and ?EI subunit of pyruvate dehydrogenase, respectively. Real time PCR experiments confirmed the expected expression correlation in most miRNAs and their target genes. Gene silencing constructions for the microRNAs ssp-miR164, ssp-miR171-seq 2, ssp-miR393 and ssp-miR528 were obtained using artificial microRNA (amiRNA) approach. Experiments on Setaria viridis transformation via Agrobacterium tumefaciens mediated calli infection emphasized the real need of a standard protocol for this proceeding, mainly due to the difficulty on calli agrobacteria disinfection step. Microtranscriptome analysis allowed the identification of differentially expressed miRNAs under drought stress, and the prediction of main pathways regulated by these sRNAs. The target genes of the four microRNAs down regulated by drought are related to processes potentially associated to important agricultural features in response to drought stress in sugarcane plants. These targets must be functionally explored in model plants with appropriated protocols, as well as in sugarcane plants. The information generated in this work increases the knowledge concerning molecular mechanisms of Saccharum complex plants in response to water deficit, and help future researches on the development of cultivars with a higher level of drought tolerance
Subject: Cana-de-açúcar
MicroRNAs
Seca
Estresse abiótico
Editor: [s.n.]
Citation: DIAS, Lara Isys. Análise do papel do microtranscritoma na tolerância à seca em cana-de-açúcar = Analysis of sugarcane microtranscritome in drought tolerance. 2015. 1 recurso online ( 115 p.). Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: <http://www.repositorio.unicamp.br/handle/REPOSIP/317043>. Acesso em: 27 ago. 2018.
Date Issue: 2015
Appears in Collections:IB - Tese e Dissertação

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