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Type: TESE
Title: Analise da expressão de genes que codificam proteinas transportadoras em Acidithiobacillus ferrooxidans e Acidithiobacillus thioxidans na presença de sulfetos metalicos
Title Alternative: Expression analyses of genes that encode for transporter protein in Acidithiobacillus ferrooxidans and Acidithiobacillus thioxidans maintained in contact with metal sulphiides
Author: Madureira, Danielle Jannuzzi
Advisor: Ottoboni, Laura Maria Mariscal
Abstract: Resumo: Acidithiobacillus ferrooxidans e Acidithiobacillus thiooxidans são espécies bacterianas acidofilicas, quimiolitotróficas e mesofilicas, encontradas em ambientes de biolixiviação. A. ferrooxidans utiliza íons ferrosos e compostos que contém enxofte como doadores de elétrons enquanto que A. thiooxidans utiliza apenas enxofte e compostos contendo enxofte. Ambas as espécies utilizam principalmente o oxigênio como receptor final de elétrons, contudo, podem também crescer em ambientes de anaerobiose. A. thiooxidans possui maior resistência ao pH podendo ser encontrada em ambientes com pH variando de 0,5 a 5,0, enquanto que A.ferrooxidans é encontrada em pHs que variam de 1,0 a 2,5. Devido a essas características e devido a capacidade dessas bactérias de solubilizar metais, A. ferrooxidans e A. thiooxidans vem sendo utilizadas em experimentos de biolixiviação. Este processo é utilizado na indústria para recuperação de cobre devido às vantagens oferecidas. Entretanto, pouco se sabe sobre a resposta gênica destas bactériaS a presença de sulfetos metálicos e dos metais pesados em solução proveniente do processo de oxidação. Na primeira parte deste trabalho foi analisada a resposta gênica da estirpe de A. ferrooxidans LR na presença e na ausência de covelita (CuS) por 24 horas através da técnica de RAP-PCR (Random Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction). Foram obtidos 19 cDNAs com expressão diferencial, dos quais 12 foram confirmados como sendo diferencialmente expressos. Dentre estes, foram isolados sete genes que codificam: proteínas de transporte (AFE 0123, AFE ,0989, AFE 0990, AFE 0580, AFE 0671, AFE 2248 e AFE 1149), a proteína diguanilato ciclase, uma proteína de membrana, uma metiltnmsferase e uma ATPase, todas induzidas na presença da covelita. Apenas o gene infC, que codifica um fator de iniciação de tradução tipo 3, teve sua expressão reprimida na presença de covelita. Como sete dos genes diferencialmente expressos pertenciam à classe de transportadores, foram investigadas às modificações químicas presentes no meio de cultura após 24 horas. Análises de absorção atômica mostraram que a quantidade de' co1?rê em solução inicialmente zero passava para aproximadamente 1,13 g/L e medidas de pH mostraram que após este período de tempo houve mudanças de 1,8 para 4,0. Pode-se sugerir que essas alterações químicas sejam responsáveis, pelo menos em parte, pela indução dos genes que codificam proteínas de transporte. Uma análise in silico da interação entre proteínas (PPI) relacionadas com transporte, cujos genes foram diferencialmente expressos na presença de covelita e de proteínas pertencentes à mesma categoria funcional, codificadas por genes que estavam fisicamente localizados nas proximidades dos genes diferencialmente expressos, mostraram que os genes de transporte podem estar envolvidos em diferentes etapas da resposta bacteriana à presença de covelita. A segunda parte deste trabalho teve como objetivo estudar a expressão diferencial, por PCR em tempo real, de duas proteínas do tipo ABC (AFE 0123 e AFE 0125) e uma proteína do tipo RND (AFE 0993) na estirpe de A. thiooxidans FGOl na presença de calcopirita (CuFeS2), covelita e pirita (FeS2) por 24 horas. Para tal, a estirpe foi crescida na presença de enxofte e depois mantida na presença dos sulfetos metálicos por 24 horas. A expressão dos três genes foi induzida na presença de covelita e inalterada na presença de calcopirita. Na presença de pirita, a expressão de dois genes foi reprimida e do gene AFE 0993, permaneceu inalterada. Estes resultados podem ser explicados, pelo menos em parte, pelas quantidades de cobre encontradas em solução na presença de covelita (l g/L) e na presença de calcopirita (0,07 g/L). Na presença de covelita e calcopirita a medida de pH também softeu aumento de 1,8 para 4,0 e 2,5, respectivamente. Para investigar se a alteração de pH ou a presença de íons de cobre eram os responsáveis pela indução da expressão desses genes, a bactéria foi mantida na presença de sulfato de cobre (16 mM) e pH 4,0 por 24 horas. Os resultados mostraram que a presença de cobre em solução induz a expressão destes genes, enquanto que a alteração do pH não

Abstract: Acidithiobacillus ferrooxidans and Acidithiobacillus thiooxidans are acidophilic, chemolitotrophic and mesophilic bacteria found in bioleaching environments. A. ferrooxidans uses ferrous iron and sulphur compounds as an e1ectron donor and A. thiooxidans uses on1y sulphur and sulphur compounds. Both species are aerobic using oxygen as final e1ectron acceptor. However, these bacteria are also able to grow in anaerobic environments. A. thiooxidans is able to survive in pHs ranging from 0.5 to 5.0 while A. ferrooxidans grows in pHs from 1.0 to 2.5. Due to these characteristics and the ability of these bacteria to solubilize metal sulphides, A. ferrooxidans and A. thiooxidans are used in bioleaching. This process has several advantages over the traditional methods and has been used with success in industrial operations to recover main1y copper. However, little is known about the genetic response of these bacteria to the presence of metal sulphides and heavy metal in solution. Therefore, in the first part of this study the A. ferrooxidans LR 'response to covellite was investigated. This bacterium was maintained in contact with covellite for 24 hours and the differentially expressed cDNAs were identified by RAP-PCR (Random Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction) technique. Nineteen cDNAs showed a differential expression and twe1ve had their differential expression confirmed by real time PCR. Among these cDNAs, seven codified for transporter proteins (AFE 0123, AFE 0989, AFE 0990, AFE 0580, AFE 0671, AFE 2248 and AFE 1149), one codified for a putative diguanylate cyc1ase, one for a membrane. protein, one for a methyltransferase and one for an A TPase. With the exception of infC whose expression was down regulated, all the oDNAs had their expression up regulated in the presence of covellite. Since most of the differentially expressed genes are involved in transport, chemical modifications on the culture medium after 24 hours were investigated. The atomic absorption analysis showed that the copper amount in solution was 1.13 g/L and pH changed from 1.8 to 4.0 suggesting that these changes are responsible, at least in part, for the induction,"?f1he expression of transport gene. An in si/ico ana1ysis of protein-protein interaction (PPI) between the transport proteins codified by the genes differentially expressed in the presence of covellite and those codified by genes that were physically located around the differentially expressed ones showed that these transport proteins could be involved in different steps of the bacterial response to covellite. The goal of the second part of this study was to analyse the differential expression, by real time PCR, of two ABC proteins (AFE 0123 andAFE 0125) and one RND protein (AFE 0993) inA. thiooxidans FGOl in the presence of chalcopyrite, covellite and pyrite for 24 hours. This strain was maintained in contact with the metal sulphides for 24 hours. The expression ofthe three genes was up regulated in the presence of covellite and unchanged in the presence of chalcopyrite. In the presence of pyrite two genes hOO their expression down regulated and in one (AFE 0993) the expression was unchanged. These results can be explained, at least in part, by the quantities of copper found in solution in covellite (1 g/L) and in chalcopyrite (0.07 g/L). In the presence of covellite and chalcopyrite the pH changed from l'.8 to 4.0 and 2.5, respectively. To investigate if the changes in pH or the presence of copper ions in solution were responsible for the induction of the gene expressions, the bacteria were maintained in the presence of copper sulphate (16 mM) and pH 4.0 for 24 hours. The results showed that the presence of copper in solution was the responsible for the up regulation ofthese genes
Subject: Acidithiobacillus
Expressão gênica
Sulfetos - Metalurgia
Language: Português
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2008
Appears in Collections:IB - Dissertação e Tese

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