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Type: DISSERTAÇÃO
Degree Level: Mestrado
Title: Analise de proteinas e genes envolvidos no metabolismo energetico e sistema antioxidante em Acidithiobacillus ferrooxidans LR
Title Alternative: Analysis of proteins and genes involved in the energetic metabolism and antioxidant system in Acidithiobacillus ferrooxidans LR
Author: Rodrigues, Viviane Drumond, 1983-
Advisor: Ottoboni, Laura Maria Mariscal, 1955-
Abstract: Resumo: Acidithiobacillus ferrooxidans é uma bactéria Gram negativa, anaeróbica facultativa, acidofílica, quimiolitotrófica e mesofílica. A. ferrooxidans é capaz de utilizar ferro e enxofre como fonte de energia e é um dos microrganismos mais utilizados no processo de biolixiviação. Durante este processo a bactéria pode estar sujeita a diversos tipos de estresse, entre eles, o estresse oxidativo. Entre os principais sensores relacionados à resposta antioxidante estão: a enzima SOD e as proteínas dos sistemas tiorredoxina e glutarredoxina. A SOD atua como defesa primária na remoção de espécies reativas do oxigênio. O sistema tiorredoxina é composto por NADPH, TrxR e Trx. O sistema glutarredoxina é formado por NADPH, GR, GSH e Grx. Os sistemas tiorredoxina e glutarredoxina desempenham um papel fundamental contra espécies reativas do oxigênio e na manutenção do ambiente redutor da célula. No primeiro capítulo, a linhagem brasileiraA. ferrooxidans LR foi utilizada para o estudo da expressão de genes dos sistemas tiorredoxina e glutarredoxina, por PCR em tempo real, em diferentes condições: (a) nas taxas de 50, 75 e 100% de oxidação de Fe2+, (b) em um e dois dias após a taxa de 100% de oxidação de Fe2+, (c) na presença de calcopirita e (d) após diferentes tempos de heat shock. Em geral, nas diferentes taxas de oxidação de Fe2+, os genes do sistema tiorredoxina foram mais expressos que os do sistema glutarredoxina. Em um dia após 100% de oxidação de Fe2+, a maioria dos genes teve expressão induzida. Em dois dias a partir desta taxa de oxidação de Fe2+, apenas os genes trxB e gor foram induzidos em relação ao controle, sugerindo que os produtos desses genes podem exercer a função de chaperona durante o estresse oxidativo. Na presença de calcopirita, apenas o gene gor foi induzido, indicando que GR pode estar envolvida no controle da homeostase celular. Esta enzima também pode ser necessária para a atividade de GSH, proteína envolvida no metabolismo de enxofre. Após o heat shock, os níveis de expressão do gene que codifica a proteína Grx3 aumentaram significativamente, possivelmente devido à propriedade de co-chaperona da proteína. No segundo capítulo foram feitas análises in silico das sequências de aminoácidos das proteínas GR, TrxR e SOD de A. ferrooxidans. A análise de in silico mostrou que existem muitas semelhanças entre as proteínas TrxR e GR, como por exemplo, estrutura secundária, peso molecular, sítio ativo, motivos funcionais e domínios. Foi realizada a quantificação de proteínas totais, a determinação da atividade em espectrofotômetro das enzimas GR e TrxR, a atividade em PAGE não desnaturante das proteínas GR e SOD e a caracterização de SOD durante o crescimento de A. ferrooxidans LR em ferro e em células mantidas em contato com a calcopirita por 1 e 10 dias. A concentração de proteínas totais foi menor em células mantidas por 10 dias em contato com a calcopirita, e uma das razões pode ser o maior estresse oxidativo. A atividade das enzimas GR, TrxR e SOD aumentou neste mesmo período de tempo, sugerindo a presença de estresse. A caracterização com KCN e H2O2 mostrou que a enzima SOD de A. ferrooxidans era do tipo FeSOD.

Abstract: Acidithiobacillus ferrooxidans is a Gram-negative, anaerobic facultative, acidophilic, chemolithoautotrophic and mesophilic bacterium. A. ferrooxidans is able to use iron and sulfur as energy source and is one of the microorganisms used in the bioleaching process. During this process, the bacterium may be subjected to several stressful situations including the oxidative stress. Among the proteins involved in the antioxidant response are the enzyme SOD and the proteins from the thioredoxin and the glutaredoxin systems. SOD removes the reactive oxygen species. The thioredoxin system is composed by NADPH, TrxR and Trx. The glutaredoxin system consists of NADPH, GR, GSH and Grx. The thioredoxin and the glutaredoxin systems play a key role against the reactive oxygen species and maintain the reducing environment of the cell. In the first chapter, the Brazilian strain A. ferrooxidans LR was used to study the expression of genes from the thioredoxin and the glutaredoxin systems, by real-time PCR, in different conditions: (a) at 50, 75 and 100% of Fe2+ oxidation, (b) in one a and in two days after 100% of Fe2+ oxidation, (c) in the presence of chalcopyrite and (d) after different periods of time of heat shock. In general, on the different rates of Fe2+ oxidation, the genes of the thioredoxin system showed a higher expression than the genes from the glutaredoxin system. In one day after 100% of oxidation of Fe2+, the majority of the genes had their expression induced. In two days after 100% of oxidation of Fe2+, only the genes trxB and gor were induced suggesting that the product of these genes may act as chaperones during the oxidative stress. In the presence of chalcopyrite, only the gene gor was induced, indicating that GR may be involved in the control of the cell homeostasis since it is necessary for GSH activity, a protein that participates in sulfur metabolism. After the heat shock, the expression of the gene that encodes the protein Grx3 increased, probably because this protein can act as a cochaperone. In the second chapter, an in silico analysis of the proteins GR, TrxR and SOD amino acids sequences from A. ferrooxidans was performed. This analysis showed that there are several similarities between TrxR and GR including, secondary structure, molecular weight, active site, functional motives and domains. Total protein content in cells grown until 80% of oxidation of Fe2+ and in cells kept for 1 and 10 days in the presence of chalcopyrite was determined. Also, in these conditions, the activities of GR and TrxR were determined in a spectrophotometer and the activities of GR and SOD were determined in gel. The total protein content was higher in control cells and in the contrary, enzyme activities were higher at 10 days of bacteria contact with chalcopyrite indicating the presence of oxidative stress. Assays with KCN and H2O2 showed that the A. ferrooxidans LR SOD was in fact a FeSOD.
Subject: Acidithiobacillus ferrooxidans
Estresse
Enzimas antioxidantes
Expressão gênica
Language: Português
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2009
Appears in Collections:IB - Tese e Dissertação

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