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Type: DISSERTAÇÃO
Degree Level: Mestrado
Title: Impacto da expressão heteróloga de xilose redutases e xilitol desidrogenases de diferentes leveduras na produção de etanol por Saccharomyces cerevisiae
Title Alternative: Impact of heterologous expression of xylose reductases and xylitol dehydrogenases from different yeasts for ethanol production by Saccharomyces cerevisiae
Author: Utsunomia, Camila, 1989-
Advisor: Goldman, Gustavo Henrique
Abstract: Resumo: A produção de etanol a partir de resíduos agrícolas, denominada Etanol de Segunda Geração ou Etanol Lignocelulósico, surge como uma alternativa para aumentar a produção de etanol sem necessariamente expandir as áreas destinadas ao cultivo da matéria-prima. A conversão da biomassa em etanol não é economicamente favorável a não ser que a hemicelulose seja utilizada juntamente com a celulose. Entretanto, a levedura Saccharomyces cerevisiae é incapaz de fermentar pentoses, açúcares liberados pela hidrólise da hemicelulose, principalmente xilose. Uma alternativa para que S. cerevisiae produza etanol utilizando pentoses seria modificá-la geneticamente através do uso de genes provenientes de micro-organismos que naturalmente realizam esta conversão. Com o intuito de encontrar novas leveduras assimiladoras de xilose, prospectamos o trato intestinal de larvas de seis insetos parasitas da cana-de-açúcar e dornas de fermentação alcoólica, identificando 49 isolados, dentre eles as leveduras Rhodotorula mucilaginosa UC11 e Ogataea polymorpha FT212L. Neste trabalho, foi feito o isolamento e a caracterização dos genes xyl1 e xyl2, que codificam respectivamente à xilose redutase (XR) e à xilitol desidrogenase (XDH) dessas duas leveduras, assim como a clonagem e a superexpressão de tais genes na cepa industrial de S. cerevisiae Pedra-2 (PE-2). Rhodotorula mucilaginosa UC11 e O. polymorpha FT212L foram avaliadas quanto a habilidade de crescerem em xilose, a expressão dos genes xyl1 e xyl2 e a medição das atividades das enzimas XR e XDH. E pela primeira vez XR e XDH de ambas as leveduras foram expressas heterologamente em S. cerevisiae PE-2 gerando as cepas PE-2 Rm, PE-2 Op 1 e PE-2 Op 2, que foram testadas quanto a capacidade de utilizar xilose para crescimento. Adicionalmente, neste trabalho também foi construída pela primeira vez uma cepa S. cerevisiae PE-2 contendo os genes de Scheffersomyces stipitis, uma vez que esta é uma das melhores leveduras conhecidas capazes de utilizar xilose. Para isso a cepa PE-2 foi modificada geneticamente com o plasmídio pRH 274, contendo os genes superexpressos de xyl1 e xyl2 de S. stipitis e o gene xks1 de S. cerevisiae, que codifica à xilulose quinase (XK), gerando a cepa denominada PE-2 274. Esta levedura recombinante foi caracterizada através de ensaios de curva de crescimento, medição das atividades de XR e XDH e capacidade de co-fermentar xilose e glicose a etanol em biorreator. A cepa PE-2 274 mostrou ser uma cepa de grande potencial para a produção de etanol a partir de meio contendo xilose e glicose, podendo ser a base para a geração de uma cepa competitiva em ambiente industrial visando à produção do etanol de segunda geração

Abstract: The ethanol production from agricultural residues, called Second Generation Ethanol or Lignocellulosic Ethanol, arises as an alternative to increase the ethanol production without necessarily expanding the areas for raw material cultivation. The biomass conversion to ethanol is not economically feasible unless hemicellulose is used in addition to cellulose. However, the yeast Saccharomyces cerevisiae is unable to ferment pentoses, released sugars from hemicellulose hydrolysis, mainly xylose. An alternative to S. cerevisiae produces ethanol from pentose is the genetic engineering with genes from microorganisms which naturally perform this conversion. In order to find new yeasts capable to use xylose, we prospected the gut of sugarcane parasitic insects larvae and alcoholic fermentation tanks, identifying 49 isolates, among them the yeasts Rhodotorula mucilaginosa UC11 e Ogataea polymorpha FT212L. In this work were made the isolation and characterization of xyl1 and xyl2 genes, which encode xylose reductase (XR) and xylitol dehydrogenase (XDH), respectively, from these two yeasts, and the cloning and overexpression of these genes in the industrial S. cerevisiae strain Pedra-2 (PE-2). Rhodotorula mucilaginosa UC11 and O. polymorpha FT212L were evaluated over the ability to grow on xylose, xyl1 and xyl2 expression analysis and XR and XDH activity. And for the first time XR and XDH from both yeasts were heterologous expressed in S. cerevisiae PE-2 generating PE-2 Rm, PE-2 Op 1 and PE-2 Op 2 strains, which were tested by the capability to grow on xylose. Additionally, in this work was constructed also for the first time a S. cerevisiae PE-2 strain with genes from Scheffersomyces stipitis, since this is one of the best known yeasts capable of utilizing xylose. For this, PE-2 was engineered with pRH 274 plasmid, containing xyl1 and xyl2 from S. stipitis and xks1 from S. cerevisiae, which encodes xylulokinase (XK), generating the PE-2 274 strain. This recombinant strain was characterized through xylose growing assays, XR and XDH activity and xylose/glucose co-fermentation to ethanol in bioreactor. PE-2 274 showed a high potential to produce ethanol from xylose and glucose, and could be the basis for the generation of industrially competitive yeast aiming the second generation ethanol production
Subject: Insetos
Saccharomyces cerevisiae
Cana-de-açúcar
Xilose
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2014
Appears in Collections:IB - Tese e Dissertação

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