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Type: TESE DIGITAL
Degree Level: Doutorado
Title: Estudos bioquímicos e estruturais da enzima glutaminase-2 (GLS2) de mamíferos
Title Alternative: Biochemical and structural studies of the enzyme glutaminase-2 (GLS2) from mammalian
Author: Ferreira, Igor Monteze, 1988-
Advisor: Ambrosio, Andre Luís Berteli
Abstract: Resumo: O câncer é uma doença que afeta milhões de pessoas no mundo a cada ano. A identificação de alvos terapêuticos para seu tratamento tem sido o assunto de extensa investigação. Atualmente, é bem estabelecido que os níveis metabólicos de células tumorais são adaptados para suportar as altas taxas de crescimento e a proliferação característica de tais células cancerosas; e uma característica comum neste contexto é o elevado consumo de glicose e glutamina. Glutaminases são enzimas multidomínios responsáveis pela reação inicial para a entrada de glutamina em vias catabólicas. Mamíferos possuem dois genes distintos para glutaminases, gls e gls2. Gls codifica para as isoformas, por splicing alternativo, KGA (Kidney-type glutaminase) e GAC (Glutaminase C), enquanto GLS2 codifica para as isoformas LGA (Liver-type glutaminase) e GAB (Glutaminase B), geradas por diferentes regiões de iniciação da transcrição. Coletivamente, KGA/GAC e LGA/GAB são normalmente referidas como GLS1 e GLS2, respectivamente. Este estudo concentra-se no entendimento dos mecanismos estruturais e catalíticos de GLS2, uma vez que recentemente esta tem sido relatada como importante para o crescimento e proliferação de tumores. Diversas construções de GLS2 humana foram produzidas para expressão heteróloga em sistemas bacteriano e de células de inseto. Uma construção que compreende o domínio de glutaminase foi cristalizada e a sua estrutura cristalina determinada por difração de raios X. Análise da estrutura sugere aminoácidos essenciais que podem ser responsáveis para os comportamentos cinéticos distintos entre GLS2 e GLS1. Em paralelo, estabelecemos um modo alostérico cooperativo de ativação para GLS2, como uma função de concentrações de enzima e substrato, bem como a presença do ativador fosfato inorgânico. Os coeficientes de Hill calculados demonstraram que o aumento da concentração de GLS2 nos ensaios culmina no crescimento da cooperação entre os monômeros, sugerindo ativação completa na forma de tetrâmeros. Análise complementares por gel-filtração analítica e microscopia eletrônica confirmam que GLS2 não se associa em oligômeros maiores do tetrâmeros - ao contrário de GLS1 - como função da concentração de proteína e presença de fosfato. Portanto, o aumento da cooperatividade, concomitante com o aumento da concentração GLS2, não afeta o número de monômeros no oligômero. Uma vez que as enzimas alostéricas frequentemente participam como reguladores chave de vias metabólicas, mediante a acumulo de outros metabolitos, testamos algumas diferentes moléculas como possíveis moduladoras de GLS2 e obtivemos que, além de fosfato inorgânico, citrato, AMP (adenosina monofosfato), glicose-6-P e frutose-6-P podem eventualmente ser ativadores GLS2 biologicamente relevantes, permitindo assim, a regulação cruzada entre as vias metabólicas distintas. Finalmente, através da resolução da inédita estrutura cristalográfica do motivo ankyrin na região de C-terminal GLS2, fomos capazes de propor um modelo molecular para a GLS2 em sua forma completa, usando restrições espaciais fornecidas por SAXS. No geral, esta coleção de resultados pode ser relevante para a futura concepção de inibidores de GLS2, podendo se tornar, assim, uma abordagem terapêutica complementar para os tumores que apresentam expressão e atividade de GLS2 aumentadas

Abstract: Cancer is a disease that affects millions of people each year worldwide. The identification of therapeutic targets for treatment has been the subject of extensive research. It is nowadays well established that the metabolic levels of tumor cells are adapted to support the high growth rates and proliferation characteristic of such cells; a common hallmark in that regard is the high consumption of glucose and glutamine by cancer. Glutaminases are multidomain enzymes responsible for the initial reaction for glutamine entry into the catabolic pathways. Mammals have two distinct genes for glutaminases, gls and gls2. Gls encodes for splicing isoforms KGA (Kidney-type glutaminase) and GAC (Glutaminase C) while gls2 encodes for the LGA isoforms (Liver-type glutaminase) and GAB (Glutaminase B), under different transcription initiation sites. Collectively, KGA/GAC and LGA/GAB are referred to as GLS1 and GLS2, respectively. This study focuses on the understanding of GLS2 structural and catalytic mechanisms since it has recently been reported as important for tumor growth and proliferation. Several constructs of human GLS2 were cloned for heterologous expression in bacteria and insect cells and a construct containing the glutaminase domain was crystallized and its crystal structure determined by X-ray diffraction. Structure analysis suggests key aminoacids that may be responsible for the distinct kinetic behaviours between GLS2 and GLS1. In parallel, we have established a cooperative allosteric mode of activation for GLS2, as a function of enzyme and substrate concentrations, as well as the presence of the well-known activator inorganic phosphate. The Hill coefficient calculation demonstrated that increasing the GLS2 concentration in the assays culminates in growth of cooperation among the monomers, suggesting full activation as tetramers. Analytical Gel Filtration and Electron Microscopy confirms that GLS2 never assembles into oligomers larger than tetramers - as opposed to GLS1 ¿ as a function of protein concentration and presence of phosphate. Therefore, the increasing of the cooperativity, concomitant with increasing GLS2 concentration, does not affect the number of monomers in the oligomer. Since allosteric enzymes often participate as key regulators of metabolic pathways, upon accumulation of other metabolites, we tested some of these ligands as possible GLS2 modulators and showed that, in addition to inorganic phosphate, citrate, AMP (adenosine monophosphate), glucose-6-P and fructose-6-P could possibly be biologically relevant GLS2 activators, thus allowing cross-talk between distinct metabolic pathways. Finally, by solving the crystallographic structure of the ankyrin repeats motif in the GLS2 C-terminal region, we are able to propose a molecular model for the full-length GLS2, using restraints provide by SAXS. Overall, this collection of results can be relevant for the future design of GLS2 inhibitors, thus becoming a complementary therapeutic approach for cancers that have increased expression and activity levels of GLS2
Subject: Metabolismo
Glutaminase
Cristalografia de proteínas
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2015
Appears in Collections:IB - Tese e Dissertação

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