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Type: TESE
Degree Level: Doutorado
Title: Estudos estrutura-função de neurotoxinas isoladas de veneno crotalico e botropico : analise comparativa de neurotoxicidade e mitoxicidade
Title Alternative: Structure-function study of neurotoxins purified of crotalic and bothropic venom: comparative analysis of the neurotoxicity and myotoxicity
Author: Ponce-Soto, Luis Alberto
Abstract: Resumo: Através de metodologias otimizadas de purificação em HPLC, foram purificadas novas toxinas a partir do veneno total de Crotalus durissus collilineatus (V-1), Bothrops jararacussus PLA2 D49 Bj-V (isoforma de Bj-IV) obtida da fração BthTX-II e Bothrops alternatus PLA2 K49 Bt II-2; com um alto grau de pureza e homogeneidade molecular, sem perda da atividade biológica. A nova neurotoxina V-1 de Crotalus durissus collilineatus caracterizada físico-quimicamente como desprovida de atividade catalítica, ácida e com uma massa molecular de 9859.45 Da, uma única cadeia polipeptídica, induz uma facilitação contínua no modelo biológico nervo frênico diafragma isolado de camundongo e uma facilitação pronunciada seguida de um bloqueio súbito em biventer cervicis de pintainho, na junção neuromuscular. Os estudos estruturais, neurotóxicos e miotóxicos da PLA2 F6 do complexo crotoxina de Crotalus durissus collilineatus mostram que a PLA2 F6 precisa da crotapotina (estudos de re-associação) para potencializar seu efeito neurotóxico na preparação nervo frênico diafragma isolado de camundongo, mas a PLA2 F6 é capaz de induzir neurotoxicidade in vitro na ausência de crotapotina na preparação biventer cervicis de pintainho. Foram purificadas, a partir da fração BthTX-II, duas PLA2 D49 Bj-IV e V, sendo consideradas como isoformas devido ao fato de que compartilham de várias características físico-químicas, tais como: massa molecular, tempo de retenção na re-purificação em HPLC de fase reversa, análise de composição de aminoácidos, pI e estrutura primária, embora a isoforma Bj-V apresente algumas mutações com respeito à isoforma Bj-IV: W3 -> F3, Q4 -> E4, F5 -> W5, I16 -> N16 e G41 -> 41D; importantes para a atividade catalítica, os efeitos neurotóxicos in vitro foram mantidos e, quando foram inibidas cataliticamente por crotapotinas crotálicas de Crotalus durissus collilineatus (F3 e F4), continuaram diminuindo a resposta contrátil na junção neuromuscular nas preparações nervo frênico diafragma isolado de camundongo e biventer cervicis de pintainho, mostrando que são mais pronunciadas no músculo esquelético de camundongo. A nova toxina Bt II-2 purificada, com um alto grau de pureza e homogeneidade molecular, do veneno de Bothrops alternatus, foi caracterizada como uma PLA2 básica K49, em função das características físico-químicas, evidenciadas: massa de 13898.71 Da, possui caráter básico e uma alta homologia seqüencial na sua estrutura primária, quando comparada com outras PLA2 K49 procedentes de veneno de serpentes.Essa nova PLA2 K49 Bt II-2 revelou um potente efeito neurotóxico in vitro na preparação nervo frênico diafragma isolado de camundongo (1 µg/mL) pré-sináptico, como foi mostrado nos estudos de estímulo indireto via nervo e potencial de membrana ou repouso, diferentemente de qualquer PLA2 neurotóxica botrópica que, para causar um efeito neurotóxico, precisa de dosagem acima de 50 µg/mL. Outros perfis biológicos foram estudados para a Bt II-2, que mostrou uma miotoxicidade local ¿in vivo¿, citotoxicidade em mioblastos e miotubos C2C12, atividade inflamatória e letalidade, corroborando que se enquadra dentro da família de proteínas PLA2 homólogas K49, mas com características únicas nos estudos de neurotoxicidade in vitro. A reprodutibilidade da atividade biológica, através dos efeitos farmacológicos, só é possível com a utilização de frações quimicamente homogêneas que mantenham a integridade da função biológica. Essas frações são obtidas com metodologias de alta eficiência: HPLC, LC, espectrometria de massa, cujos resultados podem ser associados com sua atividade biológica, eliminando a subjetividade causada por veneno total ou frações impuras. Essa abordagem pode ser aplicada nos estudos bioquímicos, estrutura-função, fisiológicos e farmacológicos, podendo revelar mecanismos ainda desconhecidos na relação estrutura-função das PLA2 procedentes de veneno de serpentes. A presença de um sítio farmacológico distinto do sítio catalítico presente nas PLA2 pode ser usada como ferramenta molecular para o reconhecimento dos receptores de membrana desconhecidos em células ou tecidos

Abstract: Through optimized methodologies of purification in HPLC, new toxins were purified from total venom of Crotalus durissus collilineatus (V-1), Bothrops jararacussus PLA2 D49 Bj-V (Bj-IV isoform) obtained from the fraction BthTX-II and Bothrops alternatus PLA2 K49 Bt II-2; with a high level of purity and molecular homogeneity, with no loss of biological activity. The new neurotoxin V-1 of Crotalus durissus collilineatus, chemically and physically characterized as unproved of catalytic, acid activity and with a molecular mass of 9859.45 Da, an only polypeptide sequence, induces to a continual facilitation in the biological isolated mouse phrenic nerve diaphragm model of mouse and a pronunciated facility of a subital block in chick biventer cervicis preparation en, in the neuromuscular junction. The structural, neurotoxic and miotoxic studies on PLA2 F6 from crotoxin complex of Crotalus durissus collineatus show crotapotin is necessary (re-association studies) to increase its neurotoxic effect in nerve phrenic diaphragm isolated preparation of mouse, but the PLA2 F6 is able to induce neurotoxity in vitro in ausency of crotopatin in the preparation chick biventer cervicis. Two PLA2 D49 Bj-IV and V were purified from the fraction BthTX-II and considered isoform because they share several chemical and physical characteristics, such as molecular mass, retention time in re-purification in reverse phase HPLC, analyses of amino acid composition, pI and primary structure, although the Bj-V isoform shows some mutations regarding Bj-IV: W3 -> F3, Q4 -> E4, F5 -> W5, I16 -> N16 e G41 -> 41D isoform. Important for the catalytic activity, neurotoxic in vitro effects were maintained and, when catalytically inhibited by crotapotin crotalic of Crotalus durissus collilineatus (F3 e F4), they continued dimishing the contractile reply in neuromuscular junction in nerve phrenic diaphragm isolated preparations of mouse and preparation chick biventer cervicis, which shows they are more pronunciated in the skeleton muscle of the mouse. The new and purified BtII-2 toxin of venom of Bothrops alternatus, with a high level of purity and molecular homogeneity, was characterized as a PLA2 basic K49, because its chemical and physical evidenced characteristics, mass of 13898.71 Da, basic character and a high sequential homology in its primary structure, when it is compared with other PLA2 K49 from venom of serpents. This new PLA2 K49 Bt II-2 has revealed a potent neurotoxic effect in vitro in neuromuscular junction in nerve phrenic diaphragm isolated preparation of mouse (1 µg/mL) ante-synaptic, as it was proved by studies on indirect stimulus through nerve and potential of membrane or rest, differently of some neurotoxic botropic PLA2 that needs a dose above 50 µg/mL to cause a neurotoxic effect. Other biological profiles were studied for the Bt II-2, and the conclusion was a local myotoxic ¿living¿, a cytotoxic in myoblasts and myotubes C2C12, imflammatory and letality activity, showing they are fitted in the family of proteins PLA2 homologous K49, but with particular characteristics in studies on neurotoxic in vitro. The reprodubility of biological activity, through pharmacological effects, is just possible with the utilization of chemically homogenous fractions that maintain the integrity of biological function. These fractions were obtained with high efficient methodologies as HPLC, LC, and mass spectrometry, whose results may be associated with their biological activities, eliminating the subjectivity caused by total venom or impure fractions. This approximation may be applied in the biochemical studies, structure-function, physiological and pharmacological, and it may reveal still unknown mechanisms in the relation structure-function of PLA2 from the venom of serpents. The presence of a pharmacological site different of the catalytic one in the PLA2 may be used as a molecular instrument to the recognition of the receptors of unknown membranes in cells or tissues
Subject: Agentes neurotoxicos
Fosfolipase A2
Veneno - Purificação
Crotoxina
Bothrops
Language: Português
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2005
Appears in Collections:IB - Tese e Dissertação

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