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Type: TESE
Degree Level: Doutorado
Title: Clonagem, expressão e avaliação do potencial biotecnológico de um inibidor de tripsina de Inga laurina em relação aos insetos pragas Diatraea saccharalis e Heliothis virescens
Title Alternative: Cloning, expression and evaluation of biotechnological potential of Inga laurina trypsin inhibitor on insect pests Diatraea saccharalis and Heliothis virescens
Author: Ramos, Vanessa da Silveira, 1983-
Advisor: Macedo, Maria Lígia Rodrigues
Abstract: Resumo: Os inibidores de tripsina têm sido utilizados com sucesso para aumentar a resistência das plantas contra os insetos. No presente trabalho avaliamos a eficiência de um inibidor de tripsina de Inga laurina (ILTI) sobre o desenvolvimento de larvas de Diatraea saccharalis e Heliothis virescens, duas importantes pragas da cana-de-açúcar e tabaco, respectivamente. Para estes fins foram utilizadas diversas estratégias (i) purificação da proteína ILTI nativa a partir de sementes de I. laurina e sua utilização para suplementação de dieta artificial fornecida como alimento às larvas dos insetos em estudo. Isto com o intuito de avaliar os efeitos do inibidor no desenvolvimento destes indivíduos; (ii) obtenção da sequência de DNA do gene ilti, clonagem, expressão e purificação da proteína recombinante assim como avaliação da sua atividade inibitória; (iii) obtenção de plantas transgênicas de cana-de-açúcar e tabaco com o gene ilti obtido a partir do DNA genômico de I. laurina ou do gene ilti-s sintetizado quimicamente usando o uso de códons da cana-de-açúcar. A adição de 0,1% (p/p) de ILTI na dieta de D. saccharalis não alterou a sobrevivência larval, mas resultou em uma redução de 56% no peso das larvas. As larvas de H. virescens que foram alimentadas em uma dieta contendo 0,5% (p/p) de ILTI apresentaram uma redução de 84% no peso. Experimentos in vitro mostraram que ILTI não foi digerido pelas proteinases do intestino médio de ambas as espécies de larvas. Ensaios trípticos permitiram observar que não houve alteração nos níveis de tripsina no intestino médio de ambos os insetos. Entretanto, verificou-se uma redução de 55,3% na atividade tríptica das fezes de D. saccharalis e um aumento de 24,1% desta atividade nas fezes de H. virescens. A atividade da tripsina em ambas as espécies alimentadas com ILTI foi sensível ao inibidor, sugerindo que nenhuma nova proteinase resistente à ILTI foi induzida. Adicionalmente, a proteína recombinante reILTI produzida em Escherichia coli apresentou atividade inibitória similar à proteína nativa em testes de atividade anti-tríptica. Com isso, reILTI pode ser considerada como uma potencial ferramenta biotecnológica. Finalmente, larvas de D. saccharalis e H. virescens foram alimentadas com plantas transgênicas de cana-de-açúcar e tabaco - respectivamente - expressando os genes ilti e/ou ilti-s. Os resultados mostraram que os transgênicos foram capazes de interferir no metabolismo dos insetos-praga testados sugerindo que esta estratégia pode ser promissora na obtenção de plantas mais resistentes ao ataque de insetos

Abstract: Trypsin inhibitors have been successfully used to increase plant resistance against insects. In this work, we evaluated the efficiency of a trypsin inhibitor from Inga laurina (ILTI) on the development of Diatraea saccharalis and Heliothis virescens, two important pests of sugarcane and tobacco, respectively. For these purposes, several strategies were employed: (i) purification of the native protein ILTI from I. laurina seeds, and its use as a supplement in the artificial diet provided for the insect larvae. This purpose was performed in order to evaluate the effects of ILTI on the development of these individuals, (ii) elucidation of the DNA sequence of the ilti gene; cloning, expression and purification of the recombinant protein (reILTI) as well as evaluation of its inhibitory activity, (iii) production of transgenic plants of sugarcane and tobacco with the gene ilti from I. laurina genomic DNA or the gene ilti-s, which was chemically synthesized using the sugarcane codon usage. The addition of 0.1% (w/w) ILTI in the diet of D. saccharalisdid not alter larval survival but resulted in a reduction of 56% in the weight of the larvae. The H. virescens larvae that were fed a diet containing 0.5% (w/w) ILTI showed an 84% decrease in weight. In vitro experiments showed that ILTI was not digested by the midgut proteinases of either species of larvae. Triptic assays allowed observe that there was no alteration in the trypsin levels in the midgut of either insect. However, there was a reduction of 55.3% in the triptic activity in the feces of D. saccharalis and an increase of 24.1% of this activity in the feces of H. virescens. The trypsin activity in both species fed with ILTI was sensitive to the inhibitor, suggesting that no novel proteinase resistant to ILTI was induced. Additionally, reILTI showed similar inhibitory activity to those of the native protein in the anti-tryptic assays. Therefore, reILTI can be considered a potential biotechnological tool. Finally, larvae of D. saccharalis and H. virescens were fed with transgenic sugarcane and tobacco plants, respectively. The results showed that transgenic plants were able to interfere with the metabolism of these insect pests, suggesting that this is a promising strategy for the production of plants that are more resistant to insect attack
Subject: Inibidores da tripsina
Controle biológico
Clonagem
Interação planta-inseto
Language: Multilíngua
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2013
Appears in Collections:IB - Tese e Dissertação

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