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Type: TESE
Title: Caracterização Cinetica e Fisico-quimica de fosfatase acidas purificadas de sementes de soja
Author: Ferreira, Carmen Veríssima, 1969-
Advisor: Aoyama, Hiroshi, 1943-
Abstract: Resumo: As quatro isofonnas de fosfatases ácidas purificadas de sementes de soj:quiescentes foram caracterizadas do ponto de vista fisico-químico e cinético. A isofonnas AP1, AP2, AP3A e AP3B apresentaram pontos isoelétricos de 4,9, 5,7 9,8 e 7,4, e quantidade de carboidratos totais de 30, 25, 18 e 10%, respectivamente Somente as isoformas AP 1 e AP3A apresentaram feITo em suas estruturas. As 4 isoformas apresentaram alta atividade catalítica à 80°C quando o pNPP foi utilizado como substrato, no entanto, quando TyrP foi utilizada, esta temperatura foi de 60 °C e para o PPi a temperatura máxima foi em tomo de 60°C para as isoformas AP 1 AP2 e AP3B e de 50°C para a isoformas AP3A. Estudos de estabilidade térmica foram realizados pré incubando-se as isoformas na ausência do substrato. Todas as isoformas perderam 20% da atividade quando pré incubadas a 60°C por 60 min. A 70°C as isoformas AP3A e AP3B mantiveram 30% de atividade residual. Todas a isoformas foram inativadas quando pré incubadas a 80°C. Estudos de estabilidade térmica na presença de alguns possíveis protetores, mostraram que os produtos da reação com o pNPP (pNP e fosfato) eram responsáveis pela estabilização de toda isoformas, favorecendo a alta atividade catalítica a 80°C. As 4 isoformas não foram significativamente afetadas por compostos que interagem com grupos -SH (pCMB, H2O2, CU²+), indicando a ausência de tais grupos no sítio ativo. Piridoxal fosfato também não apresentou efeito inibitório, (que mostra que estas enzimas não contêm resíduos de lisina essenciais para catálise. Todas as isoformas foram inibidas competitivamente pelo fosfato, vanadatc pervanadato, fluoreto e molibdato. A determinação das constantes de inibição (Ki revelou que o molibdato é o inibidor mais potente para todas as isoformas. A ConA apresentou efeito ativador somente para a isoformas API, o qual era dependente d4 substrato utilizado. As isoformas AP 1 e AP2 mostraram uma maior especificidade por substrato: que AP3A e AP3B. Foram realizados estudos cinéticos detalhados utilizando-S4 PEP, PPi, TyrP, Glic6P e Frut6P como substratos. Os resultados cinético: mostraram que estas isoformas poderiam participar em diferentes rotas metabólicas

Abstract: The four isoforms of acid phosphatase (AP1, AP2, AP3A and AP3B) purified from mature soybean seeds, had their physico-chemical and kinetil properties detennined. The APl, AP2, AP3A and AP3B isofonns presentel isoeIectric points of 4.9, 5.7, 9.8 and 7.4 and total carbohydrate of 30, 25, 18 anl 10%, respectiveIy. Among the four isoforms only APl and AP3A presented iron u their structures. The four isoforms of soybean seeds acid phosphatases presentel high activities, even at temperatures above 80°C when pNPP was utilized a: substrate. On the other hand, Iowest optimum temperature values were obtainec using other substrates. With tyrosine phosphate, the maximum activity was observec at 60°C, and when PPi was used as substrate, the optimum temperature values wen 60°C for APl, AP2 and AP3B, and 50°C for AP3A. In order to investigate the thermal stability of the four acid phosphatases, the enzymes were preincubated it the absence of substrate. The four isoforms Iost only 20% activity at 60°C, afier 60 min; the isoforms AP3A and AP3B retained 30% of activity at 70°C, after 60 min; alI the isoforms were inactivated at 80°C, after 5 min. In order to verify whether the enzymatic forms could be protected against thermal inactivation, we tested some compounds with different characteristics. The best protective effect was observec when the enzymes were incubated in the presence of both reaction products, p-nitrophenoI and inorganic phosphate. The soybean seeds acid phosphatases were not significantly affected by compounds that interacted with -SH residues (pCMB, H2O2, CU²+), indicating th absence of such residues in the active sites. Pyridoxal phosphate had no effecl suggesting that lysine residues were not important to the enzyme catalysis. The four acid phosphatase isoforms API, AP2, AP3A and AP3B wer competitively inhibited by phosphate, vanadate, molybdate and fluoride; inhibitio: constant studies showed that molybdate was the most potent inhibitor. The AP soform was activated by lectin (ConA), which effect was dependent on the substrat utilized. The AP 1 and AP2 isoforms showed higher substrate specificity whe: compared with AP3A and AP3B. Detailed kinetic properties were studied using PEP, PPi, TyrP, Gluc6P an, Frut6P as substrate. These studies suggest that these isoforms could participated I different metabolic routes
Subject: Fosfatases
Soja
Sementes
Enzimas
Language: Português
Editor: [s.n.]
Date Issue: 1999
Appears in Collections:IB - Tese e Dissertação

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