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Type: TESE
Title: Caracterização bioquimica de aminopeptidases de Xylella fastidiosa e Xanthomonas axonopodis pathovar citri
Title Alternative: Biochemical characterization of aminopeptidases from Xylella fastidiosa and Xanthomonas axonopodis pv citri
Author: Santos, Kelly
Advisor: Martin, Francisco Javier Medrano
Abstract: Resumo: Aminopeptidases realizam a clivagem de resíduos de aminoácidos de peptídios e proteínas. Elas estão presentes em todos os organismos e desempenham importantes papéis em processamento de alimentos, maturação de proteínas pela eliminação do resíduo de metionina Nterminal, patogenicidade e muitos outros processos celulares. Neste trabalho foi realizada a clonagem, expressão, purificação e caracterização de uma prolina iminopeptidase de Xylella fastidiosa(Xf1510) e de uma aminopeptidase de Xanthomonasaxonopodispv. citri (Xac2987). Estes dois genes foram anotados como prováveis prolina iminopeptidases. Ambos foram clonados em vetor de expressão pET15b, expressados em Escherichiacoli, e purificados na fração solúvel em um passo por cromatografia a metal imobilizado (IMAC). Ensaios de atividade enzimática confirmaram que a Xf1510 é uma prolina iminopeptidase, e que a Xac2987 é uma aminopeptidase de amplo espectro e não uma prolina iminopeptidase como foi anotada no banco de dados, sendo capaz de catalisar a remoção de diferentes aminoácidos de substratos sintéticos. Os espectros de dicroísmo circular das enzimas mostram que ambas podem ser incluídas na família das a/ß a/ß hidrolases e que estão enoveladas. A proteína Xf1510 apresenta maior atividade na faixa de pH entre 7,5 e 8,5. A temperatura ótima para hidrólise de prolina foi 45ºC. O pH ótimo para a atividade enzimática da proteína Xac2987 foi encontrado na faixa de pH de 6,5 e 7,5; sendo o pH ótimo 6,6. Neste pH a temperatura ótima para a hidrólise de alanina foi encontrada à 40ºC. Estudos estruturais com relação ao pH e estabilidade térmica das proteínas foram acompanhados por dicroísmo circular. Estudos de desnaturação térmica e química indicam que as proteínas Xf1510 e Xac2987 apresentam estados intermediários antes de atingirem o desenovelamento máximo

Abstract: Aminopeptidases release the Nterminal amino acid residue from polypeptides and proteins. They are present in all organisms and play several important roles in food processing, maturation of proteins by elimination of the Nterminal methionine, pathogenicity and many other cellular processes. We report here, the cloning, expression, purification and characterization of a proline iminopeptidase from X.fastidiosa(Xf1510) and a broad specificity aminopeptidase from X.axonopodispv. citri(Xac2987). These two genes have been annotated as putative proline iminopeptidase. Both genes were cloned into the pET15b expression vector, expressed in Escherichia coli, and purified to apparent homogeneity in one step by IMAC. The protein was expressed in the soluble fraction and could be purified in one step by IMAC. Enzymatic assays confirmed Xf1510 as a PIP, and Xac2987 as a broad spectrum aminopeptidase, being able to catalyze the removal of different synthetic substrates. The circular dichroism spectrum allowed us to classify the proteins as part of the a/ß hydrolyses family. Structural studies with pH dependence and thermal stability were preformatted by circular dichroism. The Xf1510 protein presents greater activity in the range of pH between 7,5 and 8,5. The optimum temperature for prolina hydrolysis was 45ºC. The pH optimum for the enzymatic activity of the Xac2987 protein was found in the range of pH of 6,5 and 7,5; being pH optimum 6,6. In this pH the temperature for alanine hydrolysis was found to 40ºC. Structural studies with regard to pH and thermal stability of proteins had been followed by circular dichroism. Studies of thermal and chemical denaturation indicate that the proteins Xf1510 and Xac2987 present intermediate states before reaching the maximum unfolding
Subject: Aminopeptidases
Xylella fastidiosa
Xanthomonas axonopodis pv. citri
Language: Português
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2006
Appears in Collections:IB - Tese e Dissertação

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