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Type: TESE
Degree Level: Doutorado
Title: Isolamento e caracterização de nova fosfolipase 'A IND.2' do veneno de Porthidium hyoprora com atividade inflamatória
Title Alternative: Isolation and characterization of a new phospholipase 'A IND.2' from Porthidium hyoprora venom with inflammatory activity
Author: Marques, Petrus Pires, 1987-
Advisor: Marangoni, Sérgio, 1951-
Abstract: Resumo: O presente trabalho teve como objeto de estudo uma fosfolipase A2 (PLA2) isolada do veneno de serpente endêmica do noroeste da América do Sul, Porthidium hyoprora. Nomeada PhTX­III, a proteína foi purificada do veneno da serpente através de duas etapas cromatográficas (gel filtração e HPLC em fase reversa) revelando-­se uma PLA2 ácida, um tipo menos comum de fosfolipase. Verificou-­se homologia entre PhTX-III e PLA2 de venenos de outras serpentes, através de experimentos de espectrometria de massas. Além disso, foi possível a observação de áreas conservadas dessas fosfolipase, como o sítio ativo e alça de ligação ao cálcio, com alterações pontuais de alguns resíduos, quando compara-se com outras PLA2 semelhantes. PhTX­III teve massa molecular exata confirmada, por experimentos de espectrometria de massas, de 13620,9 Da, pH e temperatura ótimos de 8,0 e 37°C, respectivamente. A enzima apresentou Km 4,43 mM e VMáx 10,81 U. A necessidade de íons Ca2+ para manutenção da atividade catalítica foi confirmada experimentalmente, e sua substituição por outros íons bivalentes leva à redução de poder catalítico ou até mesmo supressão total, como no caso do íon Zn2+. Assim como diversas PLA2 ácidas já descritas, PhTX-III não apresenta alguns dos mais clássicos efeitos farmacológicos para essa classe de enzimas, como miotoxicidade local, miotoxicidade sistêmica, ação anticoagulante ou antibacteriana. No entanto, uma aguda reação inflamatória pode ser observada após sua injeção, pela elevada liberação de citocinas pró-­inflamatórias IL-1?, IL-6 e TNF-? e observação de efeito edematogênico moderado. Análises morfológicas de tecido muscular de camundongo afetado pela ação da PhTX-III demonstraram a integridade do tecido com relação à dano muscular, confirmando a ausência de ação miotóxica. Foi possível observar, no entanto, a presença de infiltrado inflamatório com alta concentração de células. O uso de técnica de coloração de Dominici, específica para células da série branca do sangue, permitiu a identificação dessas células como mastócitos. Essas informações levam a acreditar que PhTX-III ocasiona uma sequencia de reações que culminam com degranulação de mastócitos, responsáveis pela liberação das citocinas inflamatórias detectadas. As características estruturais e funcionais obtidas nesse trabalho podem levar à futuras descobertas mais detalhadas sobre o funcionamento das PLA2, -­ ajudando a elucidar as relações ainda não totalmente claras entre estrutura e função dessas proteínas

Abstract: The object of study in the present work is a phospholipase A2 isolated from the venom of a South American endemic snake, Porthidium hyoprora, named PhTX-III. The protein was purified from the crude venom through two sequential chromatographic steps (gel filtration and reverse phase HPLC) and was classified as an acidic PLA2, a less common type, presenting homology with other proteins of that kind, as identified by its primary sequence analysis in mass spectrometry. The comparative analysis of the peptides obtained after PhTX-III digestion revealed not only a high identity with other acidic PLA2 but also allowed the identification of several conserved areas of these phospholipases, such as the active site and the calcium binding loop. It is also possible to observe punctual alterations in some residues when comparing it to other similar PLA2. PhTX-III had its exact molecular mass confirmed by mass spectrometry as 13620,9 Da, optimal pH and temperature of 8.0 and 3.7°C respectively. The enzyme presented Km of 4.43 mM and VmaxA of 10,81 U. The need of Ca2+ ions to maintain activity was confirmed experimentally and its substitution by other divalent ions leads to catalytic power reduction, or its total suppression, as in the case of Zn2+. PhTX-III, as well as several other PLA2 already described, doesn't present some of the most classical pharmacological effects for this class of enzymes, like local myotoxicity, systemic myotoxicity, anti-­coagulant effect of anti-­bacterial effect. Nonetheless an intense inflammatory reaction can be observed after PhTX-III injection, through an elevated pro-­inflammatory cytokine release, with high levels of IL­1?, IL-6 and TNF-?. Also it was possible to observe a moderate edematogenic effect. Morphological analysis of mice muscle injected with PhTX-III demonstrated integrity of the tissue, with no muscle damage, reassuring the previous results of the myotoxicity tests. It was possible to observe, though, the presence of inflammatory infiltrate with high concentration of cells. The use of Dominici's staining technique, specific for blood white cells, allowed the identification of these as mast cells. This information led the researcher to believe PhTX-III causes a sequence of reactions culminating in mas cell degranulation, responsible for the release of the cytokines detected. The structural and functional characteristics obtained in this work can lead to future discoveries about the PLA2 function, helping to unveil the not yet clear relationship between structure and function in this class of proteins
Subject: Citocinas
Edema
Porthidium hyoprora
Language: Português
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2015
Appears in Collections:IB - Tese e Dissertação

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