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Type: TESE
Degree Level: Doutorado
Title: Flavinas promovem mudanças na matriz extracelular, vias de transdução de sinal, enzimas antioxidantes e metaloproteinases durante a diferenciação de osteoblastos
Title Alternative: Flavins promote changes in the extracellular matrix, signal transduction, antioxidant enzymes and metalloproteinases during osteoblast differentiation
Author: Chaves Neto, Antonio Hernandes
Advisor: Ferreira, Carmen Veríssima, 1969-
Abstract: Resumo: Riboflavina (Rb - Vitamina B2) é o precursor das flavocoenzimas essenciais flavina mononucleotídeo (FMN) e flavina adenina dinucleotídeo (FAD). Estas coenzimas participam de processos enzimáticos dependentes das reações de transferências de elétrons, que ocorrem nas vias de produção de energia, biossíntese, desintoxicação e sequestro de elétrons. O aumento dietético da riboflavina e piridoxina foi associado com maiores densidades minerais em mulheres e homens idosos. Fotoderivados da riboflavina demonstraram efeitos citotóxicos em células cancerosas de próstata e leucemias, entretanto, o efeito direto da Rb e seus fotoderivados em osteoblastos não foram examinados. Neste trabalho os efeitos biológicos da Rb e riboflavina irradiada (IRb) foram investigados na linhagem de pré-osteoblastos MC3T3-E1, um modelo bem aceito de osteogênese in vitro caracterizado pela indução de genes específicos associados com o fenótipo osteoblástico quando tratados com ácido ascórbico e ß-glicerofosfato. A viabilidade celular foi avaliada através da redução do MTT, da incorporação do corante vermelho neutro e do conteúdo de ácidos nucléicos. Marcadores de diferenciação osteoblástica foram analisados através do RT-PCR semi-quantitativo (osteopontina e osteocalcina) e através de análises colorimétricas de atividade da fosfatase alcalina (FAL) e síntese de colágeno pela coloração de picrosirius. As atividades das metaloproteinases (MMP) -9 e -2 foram avaliadas pela zimografia de gelatina. Microarranjos de peptídeos com subtratos específicos para quinases e imunoblotting foram usados para identificar os efeitos na sinalização celular. As atividades de enzimas antioxidantes (superóxido dismutase, catalase, glutationa peroxidase e glutationa S-transferase) foram determinadas em lisados celulares usando métodos espectrofotométricos. As atividades das caspases-8, -9 e -3 foram analisadas através de métodos colorimétricos. Na primeira análise Rb e IRb causaram a parada do ciclo celular na fase G0/G1 e também a inibição da quinase AKT, um mediador da proliferação. Flavinas causaram a diferenciação de pré-osteoblastos, evidenciada pelo aumento da expressão de osteocalcina, osteopontina e BMP-2. Atividades mais elevadas de MMP-9 e MMP-2 também foram observadas. A capacidade das flavinas em engatilhar a diferenciação de osteoblastos foi reforçada pelo aumento da conexina 43, diminuição da caveolina-1 e repressão da sinalização Notch. Na segunda análise, nós encontramos que as interações entre Rb, em sua forma irradiada e não-irradiada, e indutores osteogênicos (ácido ascórbico e ß-glicerofosfato) afetaram significativamente a proliferação de osteoblastos, a atividade de FAL, biossíntese de colágeno, expressão de osteocalcina e osteopontina, a atividade das MMP-2 e MMP-9 e a expressão de fatores osteoclastogênicos (RANKL e osteoprotegerina). Nós também encontramos que os efeitos das flavinas em osteoblastos nesta segunda etapa foram independentes das suas propriedades antioxidantes. A atividade biológica da combinação de indutores osteogênicas com Rb e seus fotoprodutos foi associada com a ativação de diferentes vias de sinalização (AKT, FAK, CaMKII), caspases -8, -9 e -3 e aumento da expressão e/ou estabilização de fatores de transcrição osteoblásticos (Runx2 e ß-catenin). Este estudo nos trouxe fortes evidências que altas concentrações de Rb e IRb geraram um microambiente osteogênico através da modulação de diferentes vias de sinalização, além de promover um efeitos aditivo durante a diferenciação das células pré-osteoblasticas MC3T3 induzida por ácido ascórbico e ß- glicerofosfato. Em resumo, este estudo aponta para uma potencial aplicação da Rb e seus fotoprodutos no desenvolvimento do fenótipo osteoblástico e, consequentemente, uma alternativa terapêutica coadjuvante para osteoporose.

Abstract: Riboflavin (Rb-Vitamin B2) is the precursor of essential flavocoenzymes, flavin mononucleotide (FMN) and flavin adenine dinucleotide (FAD). These coenzymes participate in numerous enzymatic processes dependent on electron transfer reactions that occur in energyproducing, biosynthetic, and detoxifying and electron-scavenging pathways. Increase dietary riboflavin and pyridoxine intake has been associated with higher bone mineral density in elderly men and women. Photoderivatives of riboflavin have been shown strong activity in haematological malignancy and prostate cancer cells, however, the direct effect of Rb and its photoderivatives on osteoblast has not been examined. In this work, the biologic effects of Rb and irradiated riboflavin (IRb) were investigated in the MC3T3-E1 pre-osteoblastic cell line, a well-accepted model of osteogenesis in vitro characterized for the induction of specific genes associated with the osteoblastic phenotype when treated with ascorbic acid and ß-glycerophosphate. Cell viability was assessed by MTT reduction, neutral red uptake and nucleic acids content. Osteoblastic differentiation markers were analyzed by semiquantitative RT-PCR (osteopontin and osteocalcin), alkaline phosphatase (ALP) activity measured colorimetrically and collagen synthesis by Sirius red staining. Metalloproteinases (MMP) -9 and -2 activities were assayed by gelatin zymography. Peptide microarray of substrate specificity to kinases and immunoblotting were used to identify the effects on signal transduction pathways. Antioxidant enzyme activities (superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase and glutathione Stransferase) were determined in cellular lysate using spectrophotometric methods. Caspase-8, -9 and -3 activation were measured by a colorimetric assay. In the first analysis Rb and IRb caused cell cycle arrest at G0/G1 phase and accordingly inhibited AKT kinase, a proliferation mediator. Flavins caused differentiation of preosteoblast cells as evidenced by increase of osteocalcin, osteopontin and BMP2 expressions. In addition, higher MMP-9 and -2 activities were observed. Importantly, the capacity of flavins to trigger osteoblasts differentiation was also reinforced by upregulation of connexin 43, down regulation of caveolin-1 and negative modulation of Notch cascade. In the second analysis, we found that the interaction between Rb and IRb and osteogenic inductors (ascorbic acid and ß-glycerophosphate) significantly affected the osteoblast proliferation, alkaline phosphatase activity, collagen biosynthesis, osteopontin and osteocalcin mRNA expression, MMP-2 and MMP-9 activities and the expression of osteoclastogenesis factors (RANKL and OPG). We also showed that the effects of flavins in osteoblasts cells were independent on flavins antioxidant property. The biological activity of the combination of osteogenic medium with riboflavin and its photoderivatives was associated with the activation of different signaling pathways (AKT, FAK, CaMKII), caspases -8, -9 and -3, and up-regulation and/or stabilization of osteoblastic transcription factors (Runx2 and ß-catenin). This study brought out strong evidences that high concentration of Rb and IRb generates an osteogenic microenvironment through modulating different mediators of signaling pathways, besides of the additive effect of riboflavin and its photoproducts during the ascorbate and ß-glycerophosphateinduced osteoblast differentiation of MC3T3-E1 cells. In summary, this study pointed out the potential application of Rb and its photoproducts in osteoblasts phenotype development and, consequently, it is possible use as an alternative therapeutic adjuvant of osteoporosis.
Subject: Transdução de sinal celular
Riboflavina
Osteoblastos
Diferenciação celular
Language: Português
Editor: [s.n.]
Citation: CHAVES NETO, Antonio Hernandes. Flavinas promovem mudanças na matriz extracelular, vias de transdução de sinal, enzimas antioxidantes e metaloproteinases durante a diferenciação de osteoblastos. 2009. 123 p. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: <http://www.repositorio.unicamp.br/handle/REPOSIP/314035>. Acesso em: 14 ago. 2018.
Date Issue: 2009
Appears in Collections:IB - Tese e Dissertação

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