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Type: TESE DIGITAL
Title: Avaliação de suscetibilidade e estudo de gene de resistência de isolados clínicos de Candida albicans obtidos de espécimes clínicos no Hospital de Clínicas da UNICAMP
Title Alternative: Susceptibility evaluation and study of the resistance gene of Candida albicans isolates obtained from clinical specimens of UNICAMP Hospital and Clinics
Author: Peron, Isabela Haddad, 1989-
Advisor: Schreiber, Angélica Zaninelli, 1965-
Abstract: Resumo: Leveduras do gênero Candida são integrantes da microbiota do corpo humano e, quando há um desequilíbrio entre microbiota e hospedeiro, podem se tornar patógenos oportunistas, sendo C.albicans a espécie mais frequente. A candidíase sistêmica apresenta sintomatologia infecciosa localizada que se dissemina a outros órgãos por via hematogênica. O antifúngico fluconazol inibe a síntese de ergosterol ¿ componente essencial da membrana da célula fúngica ¿ e é amplamente utilizado para profilaxia e tratamento de infecções causadas por espécies de Candida. Enquanto algumas são geneticamente resistentes (C.krusei) ou facilmente adquirem resistência (C.glabrata) a fluconazol, não há muitos relatos de resistência em C.albicans. Porém, esta levedura pode desenvolver mecanismos de resistência a fluconazol, incluindo mutações no gene ERG11, codificador da produção da enzima que atua na biossíntese do ergosterol. O presente estudo realizou a caracterização do perfil de suscetibilidade frente a antifúngicos de isolados de C.albicans obtidos de hemoculturas, bem como a investigação da ocorrência de mutações no gene ERG11 de dois isolados de C.albicans (LIF-E10 e LIF 12560) que apresentaram resistência fenotípica in vitro a fluconazol. O estudo contou com 147 isolados de C.albicans provenientes de hemoculturas realizadas no Hospital de Clínicas/UNICAMP no período de 2006 a 2010 e também com os isolados LIF-E10 e LIF 12560, que são procedentes de outros materiais clínicos (escovado esofágico e cavidade bucal, respectivamente). Os isolados estavam previamente identificados segundo metodologia micológica manual e automação (equipamento Vitek® 2 bioMérieux). Foram reativados por meio de cultura em ágar Sabouraud dextrose e posteriormente depositados em painéis para identificação no equipamento BD Phoenix®. Os testes de suscetibilidade in vitro aos antifúngicos micafungina, anfotericina B, 5-flucitosina, fluconazol, voriconazol, itraconazol e caspofungina foram realizados por microdiluição em caldo segundo os documentos M27-A3 e M27-S4 do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). A triagem de mutações no gene ERG11 de LIF-E10 e LIF 12560 ocorreu pela amplificação de três regiões gênicas, com os iniciadores ERGSec1A/1B, ERGSec2A/2B e ERGSec3A/3B. O produto resultante foi submetido a sequenciamento e análise dos fragmentos de DNA amplificados por meio da comparação a uma cepa padrão suscetível a fluconazol (C.albicans ATCC 90028). Dos 147 isolados clínicos que passaram por reativação, 143 foram recuperados e quatro não apresentaram crescimento. Dos 143 submetidos à reidentificação no equipamento BD Phoenix®, 128 (89,5%) foram identificados como C.albicans e 15 (10,5%) foram identificados como Candida dubliniensis. Com o resultado divergente apresentado pelo BD Phoenix® em relação à identificação anterior feita pelo Vitek® 2, foi necessária a realização do sequenciamento (iniciadores ITS4/ITS5 e NL1/NL4), que resultou na confirmação dos 15 isolados como pertencentes à espécie C.albicans. Nos testes de suscetibilidade in vitro, todos os isolados de hemocultura foram caracterizados dentro da faixa suscetível (S) frente a todos os antifúngicos testados, corroborando com dados epidemiológicos mundiais que demonstram o predomínio do perfil suscetível de C.albicans. O sequenciamento do gene ERG11 dos isolados LIF-E10 e LIF 12560 revelou seis mutações (G448V e G464S para LIF-E10 e E116D, T128K, E266D e A298V para LIF 12560), todas descritas na literatura como associadas ao fenômeno de resistência de C.albicans a fluconazol

Abstract: Candida species are present in the human body microbiota and, when there is an imbalance in the relationship between microbiota and host, these yeasts can become opportunistic pathogens, being Candida albicans the most frequently found species. The systemic candidiasis presents localized infectious symptoms and is able to spread to other organs through the haematogenous route. The fluconazole antifungal inhibits the synthesis of ergosterol ¿ an essential component of the fungal cell membrane ¿ and is the most common prophylactic choice when treating candidiasis. While some species are intrinsically resistant to fluconazole (C.krusei) or are more prone to develop resistance (C.glabrata), reports on the resistance of C.albicans to fluconazole are rare. However, this species is in fact able to develop such resistance mechanisms, including the mutations of the ERG11 gene, which codifies the production of the enzyme that acts in the biosynthesis of the ergosterol. This report aimed to perform an antifungal susceptibility surveillance study on C.albicans bloodstream samples, as well as investigating mutations in the ERG11 gene on two clinical C.albicans isolates (LIF-E10 and LIF 12560) that had previously presented in vitro resistance to fluconazole. This experiment was provided with 147 samples of C.albicans isolates from hemocultures that had been conducted in the Hospital and Clinics of the State University of Campinas from 2006 to 2010, as well as the LIF-E10 and LIF 12560 isolates, obtained, respectively, from oral cavity and esophageal cavity. The bloodstream isolates had been previously identified by conventional methods and Vitek¿ 2 Systems (bioMérieux), and were reactivated through Sabouraud dextrose agar cultures, being subsequently placed in identification panels in the BD Phoenix¿ equipment. The in vitro tests to susceptibility to antifungals micafungin, amphothericin B, 5-flucytosine, fluconazole, voriconazole, itraconazole and caspofungin were performed by the broth microdilution methodology in accordance with the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) documents M27-A3 and M27-S4. The screening of the ERG11 gene mutations of the LIF-E10 and LIF 12560 isolates was obtained by amplifying three genic regions through specific PCR primers ErgSec1A/1B, ErgSec2A/2B and ErgSec3A/3B. The resulting product was submitted to both sequencing and analysis of the DNA fragments, amplified by comparing them to the standard fluconazole-sensible sample C.albicans ATCC 90028. From the 147 clinical isolates that went through reactivation, 143 were recovered, whereas four did not present any growth. From the 143 submitted to reidentification in the BD Phoenix¿ equipment, 128 (89.5%) were identified as C.albicans, and 15 (10.5%) were identified as Candida dubliniensis. Since such result presented by the BD Phoenix¿ differed from the previous identification by the Vitek¿ 2, the sequencing was necessary (primers ITS4/ITS5 and NL1/NL4), resulting in the confirmation of the 15 isolates as belonging to the C.albicans species. Regarding the in vitro susceptibility tests, all hemoculture isolates were characterized within the susceptible range (S) when facing all of the tested antifungals, corroborating with the epidemiological data that shows the dominance of the susceptible profile of the C.albicans. The nucleotide sequence analysis of the ERG11 gene of both C.albicans isolates LIF-E10 and LIF 12560 revealed 6 nucleotide mutations (E116D, T128K, E266D, A298V, G448V, and G464S to LIF 12560), all of them previously reported on the data as associated to the phenomenom of the C.albicans fluconazole resistance
Subject: Candida albicans
Antifúngicos
Candidemia
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2016
Appears in Collections:FCM - Tese e Dissertação

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