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Type: DISSERTAÇÃO
Degree Level: Mestrado
Title: Modulação da adesão plaquetaria de ratos tratados com lipopolissacarideo por especies reativas de oxigenio e nitrogenio
Title Alternative: Reactive oxygen and nitrogen species modulate the ex-vivo effects of LPS on platelet adhesion to fibrinogen
Author: Casarin, Andre Luiz
Advisor: Marcondes, Sisi, 1966-
Paschoal, Sisi Marcondes, 1966-
Abstract: Resumo: A sepse é um problema grave enfrentado em hospitais e por isso é importante mais estudos que possam esclarecer melhor a sua fisiopatologia. Alguns estudos indicam que as plaquetas podem ter um papel importante nesta condição, já que a gravidade da sepse relaciona-se positivamente com o estado de ativação destes elementos. O LPS é uma substância bastante utilizada no estudo da sepse, uma vez que mimetiza vários efeitos observados neste quadro como a grande produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e nitrogênio (ERNs). Portanto, o objetivo deste trabalho foi investigar as ações do tratamento de ratos com LPS na adesão plaquetária, bem como o envolvimento de EROs e ERNs na modulação deste(s) efeito(s). Para tanto, ratos foram injetados com LPS (1 mg/kg, i.p.) e após 2h a 48h a adesão plaquetária foi avaliada. As plaquetas aderidas aos poços foram quantificadas através da determinação da atividade da fosfatase ácida. Para investigar o papel do NO e de EROs no(s) efeito(s) do LPS na adesão plaquetária, foram realizados co-tratamentos de ratos com o inibidor da óxido sintase L-NAME ou com antioxidante N-acetilcisteína (NAC), bem como a incubação de plaquetas in vitro com o sequestrador de O2- PEG-SOD. Os níveis de GMPc em plaquetas foram determinados por radioimunoensaio. O tratamento de ratos com LPS aumentou a adesão de plaquetas não-ativadas ao fibrinogênio e diminuiu a adesão de plaquetas ativadas por trombina. O tratamento crônico dos ratos com L-NAME (20 mg/kg/dia) por 7 dias antes da injeção com LPS reduziu o aumento da adesão de plaquetas não-ativadas, mas não afetou a adesão de plaquetas ativadas. Os níveis de GMPc em plaquetas de ratos tratados com LPS foram semelhantes aos observados em animais tratados com salina. Os níveis intraplaquetários de GMPc em plaquetas não-ativadas de grupo controle ou no que recebeu o LPS foram reduzidos pelo tratamento crônico do animais com L-NAME. Entretanto, em plaquetas ativadas, o tratamento dos animais com L-NAME reduziu os níveis de GMPc somente no grupo tratado com LPS em 6h. A incubação de plaquetas não-ativadas com PEG-SOD (30 U/ml) reduziu o aumento da adesão de plaquetas de ratos tratados com LPS para níveis semelhantes aos do grupo controle, mas não modificou a adesão de plaquetas ativadas, seja a dos animais controle ou dos injetados com LPS. O tratamento de ratos com NAC (150 mg/kg, i.p.) 30 min após a injeção com LPS impediu o aumento da adesão de plaquetas não-ativadas de ratos injetados com LPS e reduziu o efeito inibitório do LPS na adesão de plaquetas ativadas por trombina. Em conclusão, o tratamento de ratos com LPS apresenta um efeito ambíguo na adesão plaquetária, já que aumenta a adesão de plaquetas não ativadas e reduz a adesão de plaquetas ativadas por trombina. O óxido nítrico (NO) modula o efeito estimulatório do LPS na adesão de plaquetas não ativadas através de mecanismos independentes de GMPc, mas não participa do efeito inibitório do LPS na adesão de plaquetas ativadas. Por outro lado, a geração sistêmica de EROs em ratos tratados com LPS modula a adesão de plaquetas não ativadas ou ativadas por trombina.

Abstract: Platelets are known as hemostatic regulators, but multiple studies have shown that platelets are important in inflammatory reactions including sepsis. Lipopolysaccharide (LPS) is a component of the outer membrane of Gram negative bacteria and has a pivotal role in inducing Gram negative sepsis. LPS triggers the production of various substances including nitric oxide (NO) and reactive oxygen species (ROS) that are involved in the organ failure and death. Therefore, we investigate the role of NO and ROS in modulating the platelet adhesion of LPS-treated rats using the model of platelet adhesion to fibrinogen-coated plates. Wistar rats were injected with LPS (1 mg/kg, i.p.) and 2 to 48h thereafter the platelet adhesion was evaluated. Microtiter plates were coated with fibrinogen, and rat washed platelet suspension (6 x 10(6) platelets) was added to each well. Adherent platelets were quantified through measurement of acid phosphatase activity. Treatment of rats with LPS significantly increased spontaneous platelet adhesion to fibrinogen-coated plates when compared to the control rats. In contrast, in thrombin-stimulated platelets LPS reduced platelet adhesion at 6 to 48h. Chronic treatment of rats with the nitric oxide sinthase inhibitor L-NAME (20 mg/kg/day) for 7 days before injection with LPS reduced the increase of non-activated platelet adhesion, whereas in thrombin-activated cells no differences were found. The cGMP levels in non-activated platelets of control or LPS-treated rats were reduced by chronic treatment of animals with L-NAME. However, the levels of cGMP in thrombin-activated platelets were reduced by L-NAME only in platelets 6h after LPS-treatment. The incubation of non-activated platelets with the O2- scavenger PEG-SOD reversed the stimulatory effect of LPS on spontaneous adhesion, but did not affected the stimulated-platelet adhesion of non-treated or LPS-treated groups. Moreover, the treatment of rats with the antioxidant N-acetylcysteine (NAC, 150 mg/kg, i.p.) 30 min after LPS injection prevented the increase of non-activated platelet adhesion as well as significantly reduced the inhibitory effect of LPS on thrombin-stimulated adhesion. Our findings suggest that NO modulates the stimulatory effect of LPS on non-activated platelet adhesion through GMPc-independent mechanisms, but it does not take part on the inhibitory effect of LPS on thrombin-activated platelet adhesion. In addition, the systemic generation of ROS in the LPS-treated rats plays an important role in both non-activated and thrombin-activated platelet adhesion.
Subject: Lipopolissacarideos
Adesão
Plaquetas (Sangue)
Espécies de oxigênio reativas
Óxido nítrico
Language: Português
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2010
Appears in Collections:FCM - Tese e Dissertação

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