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Type: TESE DIGITAL
Title: Otimização e utilização da técnica da PCR em tempo real quantitativa (qPCR) na detecção e quantificação de infecção ativa causada pelos betaherprsvírus em amostras de plasma de pacientes transplantados de células progenitoras hematopieticas (TCPH) = Optimization and use of real time PCR (qPCR) in the detection and quantification of active infection caused by betaherpesvirus in plasma sample from hematopoietic stem cell transplantation patiens
Title Alternative: Optimization and use of real time PCR (qPCR) in the detection and quantification of active infection caused by betaherpesvirus in plasma sample from hematopoietic stem cell transplantation patiens
Author: Oliveira, Renato Souza, 1978-
Advisor: Bonon, Sandra Helena Alves
Abstract: Resumo: Introdução: Os herpesvírus humanos são os maiores causadores de infecções em pacientes transplantados e em pacientes imunodeprimidos em geral. Altos níveis de HHV-6 estão associados com aumento da mortalidade e doença do enxerto contra o hospedeiro, doença pelo citomegalovírus humano e encefalites em transplantados de células progenitoras hematopoéticas. O HHV-7 pode causar febre e rash cutâneo e um possível cofator para a doença por HCMV. Atualmente, métodos moleculares de detecção e quantificação de agentes infecciosos estão sendo utilizados na rotina a fim de propiciar um tratamento precoce com antivirais adequados (terapia preemptiva), principalmente para o HCMV. A Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (qPCR) é uma das modernas opções a ser utilizada no monitoramento dos pacientes transplantados. Uma das vantagens desta técnica é a possibilidade de utilização do plasma de pacientes neutropênicos, onde esta situação frequentemente impossibilita a realização da antigenemia no sangue total. Assim o desenvolvimento de técnicas "in house" contribuem minimizando os altos gastos com kits comerciais. Objetivos: Otimizar e utilizar uma técnica de PCR em tempo real "in house" utilizando a tecnologia Taqman na detecção e quantificação de DNA dos betaherpesvírus estudados nos pacientes TCPH. Pacientes e métodos: O desenho dos primers foi realizado de regiões conservadas e especificas para os vírus. Foi realizada também a nested PCR e realizada uma a comparação entre estas técnicas. Foram obtidas de forma prospectiva, semanalmente, amostras de plasma de 60 pacientes TCPH, desde o dia do transplante até o dia +100 após o transplante. Os resultados obtidos foram comparados a um grupo controle pareados por sexo e idade e com pacientes transplantados de órgãos sólidos, no caso, pacientes transplantados cardíacos. Resultados: Dos 60 pacientes estudados, 30 foram do sexo masculino e 30 do feminino. Infecção ativa pelo HCMV, HHV-6 e HHV-7 detectada pela Nested-PCR no plasma ocorreu em 61,7%, 23,3% e 51,7%, com mediana de 34 dias (variação 2-91 dias), 24 dias (variação 1-96 dias) e 15 dias (variação 0-98 dias), respectivamente. Antigenemia positiva para HCMV em 48,3%, mediana 40 dias (variação 20-91 dias) após o transplante. A qPCR para HCMV, HHV-6 e HHV-7 ocorreu, respectivamente, em 70%, 16,7% e 41,7%, com medianas de 26, 20,5 e 20 dias. Em 5/37 (13,5%) pacientes com infecção ativa pelo HCMV foram a óbito em menos de 100 dias após o transplante (mediana 50 dias, variação 46-100 dias) e 2/5 (40%) tiveram como causa principal do óbito doença por HCMV. Quatorze com infecção ativa pelo HCMV (24,6%) apresentaram GVHD agudo e overlap. Em relação o número de células positivas pela antigenemia, a mediana encontrada foi de 31 células. Cinco pacientes (8,8%) apresentaram doença por HCMV no trato gastrointestinal (TGI), comprovados por biópsia. Infecção ativa pelo HHV-6 no plasma foi diagnosticada em 12/57 pacientes (21%), numa mediana de 24 dias após o transplante (variação 0-84 dias). Um paciente com HHV-6 positivo (8,3%) foi a óbito em menos de 100 dias após o transplante e teve coinfecção pelo HCMV, indo a óbito por este agente. Quatro pacientes com HHV-6 (33,3%) apresentaram GVHD agudo e overlap. HHV-7 ocorreu em 31/57 (54,3%) mediana 15 dias após o transplante (variação 0-98 dias). Em 3/31 pacientes com HHV-7 (9,7%) foram a óbito em menos de 100 dias após o transplante e tiveram como causa principal do óbito GVHD agudo e infecção bacteriana. Oito pacientes com HHV-7 (25,8%) apresentaram GVHD agudo e overlap. Conclusão: O diagnóstico rápido e precoce destas infecções poderá auxiliar na rotina diagnóstica e de tratamento dos pacientes que são foco deste estudo e de outros pacientes que poderão se beneficiar com nosso trabalho

Abstract: Introduction: Human herpesviruses (HHV) are the major causes of infections in transplant and Immunocompromised patients in general. High levels of HHV-6 are associated with increased mortality, graft versus host disease (GVHD), HCMV disease and encephalitis in hematopoietic stem cell transplant (HSCT) patients. HHV-7 can cause fever, rash and is possible cofactor for HCMV disease. Currently, molecular methods for detection and quantification of infectious agents are being used in routine in order to provide early treatment with appropriate antiviral (preemptive therapy), mainly for HCMV. The Real Time Polymerase Chain Reaction (qPCR) is one of the modern options to be used in the monitoring of transplant patients. One advantage of this technique is the possibility of using plasma from neutropenic patients, where this situation often affect the realization of HCMV antigenemia in whole blood. Thus, the development of "in house" techniques can minimize the high costs using commercial kits. Objectives: To optimize and to use Real Time PCR technique "in house" with the Taqman technology for the detection and quantification of betaherpesvírus DNA from HSCT patients. Patients and methods: The primers design was performed of conserved and specific regions for viruses. It was also performed a nested PCR and a comparison between these techniques. Plasma samples from 60 HSCT patients were prospectively obtained, weekly, from the transplantation day until day +100 post-transplant. The results were compared to a control group matched for sex and age and solid organ transplant patients, in this case, heart transplant patients. Results: Of the 60 patients studied, 30 were male and 30 were female. Active HCMV, HHV-6 and HHV-7 infection were detected by nested PCR in plasma in 61.7%, 23.3% and 51.7%, with a median of 34 days (range 2-91 days), 24 days (range 1-96 days) and 15 days (range 0-98 days), respectively. HCMV antigenemia test was positive in 48.3%, in a median range of 40 days (20-91 days) after the transplant. The qPCR optimized for HCMV, HHV-6 and HHV-7 were positive, respectively, in 70%, 16.7% and 41.7%, with a median of 26, 20.5 and 20 days after transplant. Five out of 37 (13.5%) patients with active HCMV infection died in less than 100 days after transplantation (median 50 days, range 46-100 days) and in 2/5 (40%) the main cause of death was HCMV disease. Fourteen patients with active HCMV infection (24.6%) had acute GVHD and overlap. In relation of the number of positive cells for antigenemia, the median was 31 cells. Five patients (8.8%) had disease by HCMV in the gastrointestinal (GI) tract, proven by biopsy. Active HHV-6 infection in plasma was detected in 12/57 patients (21%), in a median of 24 days after transplantation (range 0-84 days). One patient with HHV-6 positive (8.3%) died in less than 100 days after the transplant and had coinfection by HCMV, and died by this agent. Four patients with HHV-6 (33.3%) had acute GVHD and overlap. HHV-7 occurred in 31/57 (54.3%) in a median of 15 days after transplantation (range 0-98 days). Three patients with HHV-7 (9.7%) died in less than 100 days after transplantation and their main cause of death were acute GVHD and bacterial infection. Eight patients with HHV-7 (25.8%) had acute GVHD and overlap. Conclusion: The rapid and early diagnosis of these infections can assist in diagnosis routine and patients treatment that were the focus of this study and other patients who can benefit from our work
Subject: Betaherpesvirinae
Reação em cadeia da polimerase
Técnicas e procedimentos diagnósticos
Transplante de células-tronco hematopoéticas
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2015
Appears in Collections:FCM - Dissertação e Tese

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