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Type: DISSERTAÇÃO
Degree Level: Mestrado
Title: Caracterização das fosfodiesterases (PDE) de GMPc nas celulas de linhagem eritroide e efeitos de drogas inibidoras de PDE na produção de hemoglobina fetal
Title Alternative: Characterization of cGMP-specific phosphodiesterases (PDE) in erythroid cells and effects PDE inhibitors on the production of fetal hemoglobin
Author: Almeida , Camila Bononi de
Advisor: Zorzetto, Nicola Amanda Conran, 1972-
Abstract: Resumo: A anemia falciforme é um distúrbio genético causado por uma mutação de ponto (Ácido Glutâmico-Valina) que produz uma hemoglobina S. Esta, quando desoxigenada, polimeriza causando deformação dos eritrócitos que se agregam às paredes da micro circulação culminando em crises vaso-oclusivas. Existem algumas moléculas de adesão que colaboram no bloqueio da circulação aderindo eritrócitos, células brancas e plaquetas à parede dos túbulos sanguíneos. A hidroxiuréia (HU) vem sendo utilizada no tratamento da doença devido à sua habilidade em aumentar a produção de hemoglobina fetal (HbF). No entanto, nem todos os pacientes respondem positivamente ao tratamento com HU. Estudos mostram que a HU quando degradada, produz óxido nítrico (NO), o qual ativa a enzima guanilato ciclase solúvel (GCs). Esta, por sua vez, transforma GTP em GMPc que atua como segundo mensageiro ativando provavelmente a transcrição do gene ?-globina aumentando assim, a concentração de HbF e melhorando o quadro clínico dos pacientes com essa doença. Por isso, o NO tornou-se fonte de grandes estudos, uma vez que é um importante vasodilatador. O objetivo desse trabalho foi elucidar qual família de fosfodiesterase (PDE) atua na degradação do GMPc das células de linhagem eritróide e se as drogas inibidoras dessas PDEs seriam capazes de aumentar a produção de ?-globina e conseqüentemente HbF em células eritróides de cultura. Para isso foram realizadas culturas de células K562 tratadas com diferentes drogas inibidoras de PDE (vinpocetina, sildenafil, dipiridamol e zaprinast) e com estimulador de guanilato ciclase, BAY41-2272. Observamos que os níveis de GMPc aumentaram principalmente nas células tratadas com 10µg/ml de dipiridamol e em alguns pontos de coletas com 10 e 50µM de vinpocetina. O mesmo não foi observado nas células tratadas com sildenafil e zaprinast. No entanto, todas as células tratadas com as diferentes concentrações de BAY41-2272 apresentaram aumento na concentração de GMPc. Com relação à expressão gênica relativa de ?-globina, observamos que as drogas dipiridamol, vinpocetina, sildenafil e zaprinast não foram capazes de provocar um aumento da expressão. Diferentemente, BAY41-2272 estimulou um aumento da expressão de ?-globina nas células K562 tratadas com 60 e 300nM após 48 horas de cultura. Além disso, estudamos a expressão das PDEs 1, 5 e 9 em células hematopoéticas e diferentes tecidos. Observamos que PDE9 é significativamente mais expressa em células K562, reticulócitos e neutrófilos. Além disso, observamos também que a expressão dessa PDE é significativamente maior nos reticulócitos e neutrófilos de paciente com anemia falciforme. Já naqueles que se encontravam sob terapia com HU, a expressão da PDE9 nos reticulócitos reverteu aos níveis do controle diferentemente dos neutrófilos, cuja expressão de PDE9 não se alterou entre os pacientes com ou sem terapia com HU. A expressão da PDE9 em outros tecidos (T98G, cólon, ovário, mama, fígado, pele, baço, testículo, útero e linfonodo) é significativamente menor do que nestas células hematopoéticas. Assim sendo, como aumento nos níveis celulares de GMPc pode ser importante tanto para a produção de HbF em células eritróides como para inibir a adesão de leucócitos, bloquear a ação da PDE9 pode representar uma nova estratégica célula-especifica para o tratamento da anemia falciforme

Abstract: Sickle cell disease (SCD) is a systemic disease with a multifaceted pathophysiology; the polymerisation of the sickle haemoglobin molecule (HbS), when deoxygenated, has many consequences that include haemolysis, inflammation, dysregulated nitric oxide (NO) homeostasis and oxidative abnormalities. Agents, such as hydroxyurea (HU), that increase levels of fetal hemoglobin (HbF), with consequent inhibition of HbS polymerization, and that may counteract other aspects of the disease's pathophysiology characterize important therapies for the disorder. Whilst HU therapy successfully augments HbF levels in many patients, not all patients respond to treatment. Studies demonstrate that HU, when degraded, produces nitric oxide (NO), in turn activating the enzyme, soluble guanylate cyclase (GC) in erythroid lineage cells. GC converts GTP to cGMP, which acts as a second messenger for NO, possibly activating the transcription of the ?-globin gene and, consequently, increasing the concentration of HbF. Due to evidence that NO bioavailability may be decreased in SCD individuals, recent research into SCD has focused on the role of NO in the disease, particularly since this gas is an important vasodilator. The objective of this study was to investigate which family(ies) of phosphodiesterases (PDE) may mediate the degradation of cGMP in erythroid lineage cells and whether drugs that inhibit these PDEs are capable of augmenting the production of ?-globin and, consequently, HbF in erythroid cells in culture. For this, cultures of K562 erythroleukemic cells were treated with different PDE inhibitors; vinpocetine, sildenafil citrate, dipyridamole and zaprinast. In addition, cultures were also treated with the guanylate cyclase stimulator, BAY41-2272. Increased levels of cGMP were observed principally in cells treated with 10µg/ml dipyridamole and at some time-points in the presence of 10 and 50µM vinpocetine. No changes in cGMP levels were observed in cells treated with sildenafil nor with zaprinast. However, cells treated with BAY 41-2272 demonstrated augmented cGMP levels at all concentrations used. With regard to relative ?-globin gene expression, dipyridamole, vinpocetine, sildenafil and zaprinast did not increase ?-globin gene expression; in contrast, BAY 41-2272 (60 and 300nM) stimulated increased ?-globin expression after 48h of culture. The gene expressions of PDEs 1, 5 and 9 were also studied in different hematopoietic cell types and other tissues. PDE9 is expressed, at significantly higher levels, in K562 cells (erythroleukemic cells), reticulocytes and neutrophils than in numerous other cell types tested (T98G, colon, mammary, ovary, testicle, liver, skin, spleen, uterus, limphonode). Furthermore, the expression of this PDE was even higher in the reticulocytes and neutrophils of patients with SCD. In patients on HU therapy, the expression of PDE9 in reticulocytes was reversed back to levels similar to those seen in controls. In contrast, PDE9 expression in neutrophils was similar in patients on or of HU therapy. Thus, since the increase in intracellular levels of cGMP may be important for the production of HbF in erythroid cells and also to inhibit leukocyte adhesion, the inhibition of the action of PDE9 may represent a novel drug target for cell-specific treatment of SCD
Subject: Anemia falciforme
Language: Português
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2006
Appears in Collections:FCM - Tese e Dissertação

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