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Type: TESE
Title: Avaliação do transcriptoma da leucemia mieloide cronica por ORESTES (Open Reading Frame Expression Sequence Tags)
Title Alternative: CML transcriptome analysis using ORESTES (Open Reading Frame Expression Sequence Tags)
Author: Alberto, Fernando Lopes
Advisor: Costa, Fernando Ferreira, 1950-
Abstract: Resumo: Câncer é o resultado de anomalias no genoma acumuladas ao longo do tempo e corresponde a doença genética mais freqüente na população humana. Os últimos anos têm presenciado enormes avanços tecnológicos que facilitaram o desenvolvimento de técnicas para análise em larga escala do conjunto dos genes expressos nos diferentes tecidos, sendo responsável pela explosão do conhecimento em medicina molecular. No presente trabalho avaliamos o transcriptoma da leucemia mielóide crônica através da técnica de ORESTES (Open Reading Frame Expressed Sequence Tags). As seqüências geradas foram agrupadas de acordo com sua homologia através do pacote de bioinformática Phrap. Essa estratégia aumentou o grau de cobertura genômica, já que as seqüências originais apresentavam tamanho máximo de 500 a 700 bases. Após a retirada dos contaminantes, obtivemos 2933 agrupamentos de seqüências (contigs) e 11568 seqüências isoladas. Cada contig representa um gene em potencial e o seu conjunto foi submetido a comparação com o banco de dados público nr para possibilitar a anotação e classificação funcional. Os agrupamentos ORESTES foram classificados em comunicação celular (19%); crescimento, desenvolvimento e manutenção celular (9%); metabolismo celular (30%); estrutura, motilidade e transporte celular (15%); função desconhecida (28%). Adicionalmente, estabelecemos o mapeamento cromossômico dos contigs obtidos, observando distribuição relativamente homogênea e proporcional representada em todos os cromossomos humanos. O mapeamento dos contigs gerados por ORESTES apresentou-se com padrão de distribuição semelhante ao observado por Venter e colaborasores, 2001. Comparamos o padrão de expressão obtido com o transcriptoma de medula óssea de paciente portador de anemia hemolítica hereditária (doença hematológica não neoplásica) gerado por SAGE (Serial Analysis of Gene Expression). Os genes encontrados foram ordenados de acordo com sua representatividade ou nível de expressão. Não houve correlação entre os padrões de expressão observados pos SAGE e por ORESTES. Do conjunto dos 100 genes mais representados nos ORESTES, dez foram selecionados para validação da expressão por PCR quantitativo em tempo real, utilizando o agente fluorescente SybrGreen I. Identificamos e confirmamos o aumento da expressão em nove genes na LMC. Destes, sete tinham aumento superior a 10 vezes o controle (CAMP, ABR, DEFA3, CSF3R, MLL2, S100A8 e MS4A3), com dois deles (DEFA3 e ABR) com aumento de cerca de 50 vezes ou mais. A análise funcional particularizada para cada um deste genes em LMC tem o potencial de identicar possíveis alvos para novas intervenções terapeuticas. O método mostrou-se poderoso para evidenciar e validar as diferenças de expressão gênica observadas pelas técnicas de seqüenciamento utilizadas anteriormente. Os dados deste trabalho constituem a primeira descrição do transcriptoma da leucemia mielóide crônica

Abstract: The complete collection of transcripts generated from the human genome cannot be predicted from the genome sequence, but should be directly determined for each tissue, due to variations of gene expression in different tissues and disease states, and because genes can encode multiple transcripts derived from alternate splicing and polyadenylation sites. As part of larger project that produced up to 1.2 million ORESTES (open reading frames expressed sequence tags) from different cancer tissues, we constructed a set of cDNAs obtained from bone marrow cells of patients with CML, that represented partial expressed gene sequences that are biased toward the central coding regions of the resulting transcripts (Dias-Neto E et al, Proc Nat Acad Sci USA 97:3491, 2000). The 27,361 ESTs were assembled into contigs using the Phrap package producing 2933 clusters containing 2 to 210 ESTs (leaving 11568 isolated sequences). Functional categories were attributed to the contigs on the basis of the annotation of the matched sequences in nr, into 5 major functional categories and 22 subcategories (cell communication (19%); cell growth, development and m contigs formed by the larger number of EST in bone marrow cells was co mpared with a control bone marrow sample obtained from a non-neoplastic hematologic condition (hereditary hemolytic anemia) and evaluated with SAGE (serial analysis of gene expression). Ten out of 100 most representative contigs had their expression data evaluated further by realtime quantitative PCR with Sybr Green I reagent, confirming the ORESTES data. Seven out of the 10 genes were more than 10-fold upregulated (CAMP, ABR, DEFA3, CSF3R, MLL2, S100A8 e MS4A3) and two additional genes were 50-fold or higher upregulated in CML (DEFA3 e ABR). The wealthy of information provided by this approach demonstrates its usefulness for the analysis of gene expression in specific hematopoietic tissues and diseases
Subject: Reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa
Expressão gênica
Leucemia mielóide crônica
Language: Português
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2003
Appears in Collections:FCM - Tese e Dissertação

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